电针对WKY抑郁模型大鼠行为学及前额叶皮质GLUR1、NR2B蛋白表达的影响

李晓慧,秦丽娜,邢龙飞,黄树航,冯荣荣

(1.北京中医药大学,北京 100020;2.北京中医药大学第三附属医院,北京 100029)

抑郁症作为一种临床多见的精神障碍性疾病,常表现为情绪低落、缺乏活力、悲观、睡眠障碍等症状[1],具有持续性、反复性等发病特点,严重损害了患者正常的社会和职业功能[2]。世界卫生组织公布抑郁症已经影响约3亿人,至2017年已成为全球致残的主要原因[3-4],此外,抑郁症患者自杀念头也成为了该病死亡率高的主要原因。抑郁症已然成为了一个日益严重的公共健康问题。目前现代医学的治疗方法以药物治疗最为广泛,传统的抗抑郁药物虽然有较好的治疗效果,但其起效时间较长,许多抑郁症患者对药物易产生耐受,且具有较大的副作用,因此,抗抑郁药物并未达到理想的治疗效果[5]。关于抑郁症的发病机制有单胺类神经递质失调、神经内分泌系统失调、免疫及细胞因子失调、脑源性神经营养因子失调、突触可塑性失调等学说,其中,突触可塑性近年越来越受到学界重视,有助于揭示抗抑郁的新靶点[6]。本研究采用普遍存在抑郁样行为的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,观察电针百会、印堂穴对WKY抑郁大鼠行为学、前额叶皮质突触相关蛋白谷氨酸受体(glutamate receptor1, GLUR1)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic Acid, NMDA)受体2B亚基(NR2B)表达的影响,进一步揭示电针产生抗抑郁效应的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性 WKY抑郁大鼠 45只,Wistar大鼠15只,体质量(210±20)g,6周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号 SCXK(京)2016-0006,购进后适应性饲养于中日友好医院临床研究所动物房内1周,每笼3只,动物自由摄食环境,饲养室温度(19～25)℃、湿度 53%～57%,自然昼夜节律。本实验涉及方案经中日友好医院伦理委员会审查批准(No.zryhyy21-21-05-01),本实验均依照中日友好医院实验动物管理准则和规定进行。

1.2 主要试剂与仪器

蔗糖(天津市北辰方正试剂厂);NR2B抗体(Ab65783, Abcam);GLUR1抗体(Ab174785, Abcam);山羊抗兔 IgG-HRP(111-035-003, Jackson Immuno-Research);山羊抗小鼠 IgG-HRP(115-035-003,Jackson ImmunoResearch);BCA蛋白定量试剂盒(#7780,CST);化学发光仪(WD-9423C,六一仪器);电泳仪(Powerpac Basic,美国伯乐 Bio-Rad);低温冷冻离心机(Fresco17,美国热电 Thermo Fisher);自制旷场实验箱(80 cm×80 cm×40 cm);电针仪(华佗牌,规格SDZ-Ⅱ)。

1.3 分组与操作

将15只Wistar大鼠作为正常组,将45只WKY抑郁大鼠随机分为电针组、假针组和模型组,每组15只。电针组大鼠适应性喂养 1周后,运用自制布袋进行束缚,仅将头部露出布袋口,参照《实验针灸学》[7]对腧穴进行定位,分别选取百会和印堂穴,选用规格为0.25 mm×25 mm毫针,百会穴向后头部方向予以平刺,印堂穴向鼻尖方向予以平刺,针刺深度为 5～10 mm。针刺后连接华佗牌电针仪,正极与百会穴相连,负极与印堂穴相连,予以连续波频率2 Hz,电流由0.1 mA开始逐渐加大,根据大鼠耐受程度,以头部出现微微颤动而不挣扎、嘶叫为度,治疗时间为每次 20 min,每日1次,共治疗21 d。为避免不同人的针刺操作差异,针刺均由同一人完成。假针组大鼠适应性喂养1周后采取同样的束缚方法予以固定,运用规格为0.25 mm×25 mm针灸针刺入大鼠百会和印堂穴的皮层,不刺入肌肉层,以防止非特异性针刺效应,刺入深度为 1～2 mm,将针灸针与电针仪导线相连,但不予以通电。留针时间、治疗疗程及其他注意事项均与电针组相同。正常组与模型组常规饲养,不予干预。

1.4 指标检测

1.4.1 大鼠体质量

分别于实验开始前1天、实验结束后测量并记录每只大鼠的体质量,然后对各组大鼠体质量的差异进行统计分析。

1.4.2 旷场实验[8]

分别于实验开始前1天、实验结束后进行旷场实验测评。保持实验室周围环境安静。将每只大鼠放入旷场箱底面的中央方格内,由两名实验记录者分别记录大鼠在5 min内的水平运动和垂直运动的频次。以穿越旷场箱底面正方形块数为水平穿越格数,大鼠3只爪子穿越一格计为1分,得分为大鼠的水平穿越格数;以大鼠两前肢离开地面次数为垂直起立次数,大鼠两前爪腾空、亦或攀附旷场箱侧壁方计为1分,得分为垂直起立次数。每只大鼠检测1次,测试完后清除旷场箱内的大鼠粪便及尿液,并用 75%医用乙醇溶液进行清洁擦拭旷场箱底面,以避免上一只大鼠残留的气味影响下一只大鼠的实验测评,待乙醇挥发完毕后继续实验。

1.4.3 糖水偏好实验[9]

在实验开始前 4天,训练所有大鼠适应性饮用1%蔗糖水(蔗糖30 g,溶于实验动物饮用水中,定容至 3 L),训练过程中皆双瓶饲养。第 1天,两瓶均装1%蔗糖水;第2天,一瓶装纯净水,一瓶装1%蔗糖水;第 3天,实验动物禁食禁水。禁食禁水 24 h后,在下午14:00—15:00,每笼同时予以提前称好1瓶纯净水和1瓶1%蔗糖水,2 h后交换瓶子位置,4 h后取走两瓶,分别进行称重。糖水偏好指数＝[糖水消耗量/(糖水消耗量＋纯水消耗量)]×100%。该实验分别于实验开始前和实验结束后进行测试。

1.4.4 大鼠前额叶皮质GLUR1、NR2B蛋白检测

行为学实验结束后第 2天,各组大鼠麻醉断头于冰上取前额叶皮质并称重,BCA法检测蛋白浓度。制胶、制样,电泳参数设置为恒压80 V,20 min后转为12O V,转膜参数为恒流300 mA恒流,转膜时间以目的蛋白分子大小而定。5%脱脂牛奶中封闭 60 min,加入一抗(NR2B浓度为1:2 000;GLUR1浓度为1:4 000)室温孵育15 min,放4 ℃摇床过夜,TBST溶液洗膜3次,每次5 min,加入二抗(1:10 000),室温轻摇 60 min,TBST溶液洗膜3次,ECL曝光成像并运用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.5 统计学方法

所有数据采用统计软件SPSS20.0进行统计分析。符合正态分布且方差齐的要求,实验数据用均数±标准差表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较各组间的差异;数据不符合正态分布或方差不齐,采用非参数检验进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠实验前后体质量比较

实验前,同周龄 WKY抑郁大鼠体质量明显低于正常组大鼠,经过21 d电针治疗后,正常组大鼠体质量增长明显高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01);电针组大鼠的体质量增长明显高于假针组和模型组,差异有统计学意义(P＜0.01)。说明电针可增加抑郁大鼠摄食量,缓解体质量减轻的症状。详见表1。

表1 各组大鼠实验前后体质量比较 (±s, g)

表1 各组大鼠实验前后体质量比较 (±s, g)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与电针组比较2)P＜0.01

组别 n 实验前 实验后正常组 15 268.16±10.87 412.36±26.12电针组 15 237.74±8.331) 327.47±24.991)假针组 15 243.21±10.951) 282.89±17.031)2)模型组 15 242.98±11.771) 296.45±20.961)2)

2.2 各组大鼠实验前后旷场实验结果比较

实验前与正常组大鼠比较,WKY抑郁大鼠水平穿越格数、垂直运动次数明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01)。实验后与正常组大鼠比较,模型组大鼠水平穿越格数、垂直运动次数明显减少,差异具有统计学意义(P＜0.01);与假针组和模型组比较,电针组大鼠水平穿越格数、垂直运动次数增加,差异具有统计学意义(P＜0.01)。说明电针可以改善WKY抑郁模型大鼠的活动能力、探索行为及好奇程度。详见表2。

表2 各组大鼠实验前后水平穿越格数与垂直运动次数比较 (±s)

表2 各组大鼠实验前后水平穿越格数与垂直运动次数比较 (±s)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与电针组比较2)P＜0.01

组别 时间 n 水平穿越格数(格) 垂直运动次数(次)正常组 实验前 1 5 4 6.8 0±6.8 9 2 3.2 0±3.5 3实验后 1 5 4 8.2 7±8.7 0 2 2.6 7±3.0 2电针组 实验前 1 5 2 1.5 3±7.2 6 1) 5.3 3±2.5 6 1)实验后 1 5 3 3.4 0±6.1 7 1) 1 3.4 7±2.6 3 1)假针组 实验前 1 5 1 9.2 7±6.5 8 1) 6.6 7±2.0 9 1)实验后 1 5 2 1.8 7±4.8 1 1)2) 6.2 7±2.0 7 1)2)模型组 实验前 1 5 1 9.7 3±7.5 4 1) 5.7 3±2.3 7 1)实验后 1 5 2 0.0 0±6.2 3 1)2) 5.8 7±2.1 7 1)2)

2.3 各组大大鼠实验前后糖水偏好实验验测评结果比比较

实验前与正常组比较较,WKY抑郁大鼠糖水消耗耗百分比明显降低,差异有统统计学意义(PP＜0.01),实验验后与正常组比较较,模型组大大鼠糖水消耗百百分比明显降降低,差异有统计学意义(P＜00.01);与模型型组比较,电针针组糖水消耗百百分比明显升升高,差异有统统计学意义((P＜0.01);与假针组比较,电电针组大鼠糖水消耗百分比比增加,差异具有有统计学意义义(P＜0.01)。说明电针可改改善抑郁大鼠快感感缺失的症状状。详见表3。

表3 实验前前后各组大鼠糖糖水消耗百分比比比较 (±s,%)

表3 实验前前后各组大鼠糖糖水消耗百分比比比较 (±s,%)

注:与正常组比较1)P＜0.011;与电针组比较较2)P＜0.01

组别n 实实验前 实验后正常组15 79.000±4.03 15 68.000±3.60 15 67.000±4.52 15 68.000±3.20 80.00±3.67电针组假针组模型组1)1)1)72.00±3.311)68.00±3.501)69.00±5.061)2)2)

2.4 各组大大鼠前额叶皮质 GLUR1、NR2B蛋白表达水水平比较

与正常组组比较,模型组大鼠GLUR1、NR2B蛋白表表达水平明显降低,差异有统统计学意义(PP＜0.01);与模模型组比较,电针针组GLUR1、NNR2B表达水平平上调(P＜0..05,P＜0.01);与与假针组比较较,电针组GLURR1、NR2B表达达水平上调,差异有统计学学意义(P＜00.05);而模型型组GLUR1、NR2B蛋白表达水平变化无统统计学差异(P＞0.05)。详见见表4。

图1 各组大鼠干干预14天后前额额叶皮质GLUR1、NRR2B蛋白条带图图

表4 各组大鼠前前额叶皮质GLURR1、NR2B表达达水平比较(±s)

表4 各组大鼠前前额叶皮质GLURR1、NR2B表达达水平比较(±s)

注:与与正常组比较1)P＜0.05,2)PP＜0.01;与电针针组比较 3)P＜00.05,4)P＜0.01

组组别 n G L U R 1/β--a c t i n N R R 2 B/β-a c t i n正正常组 5 1.8 6±0 0.6 7 1.3 5±0.3 5电假模电针组 5假针组 5模型组 5 1.3 3±0 0.6 4±0 0.5 9±0 0.4 3 0 0.2 6 2)3) 0 0.2 4 2)3) 0.8 9±0.2 3 1).4 1±0.2 4 2)3).3 3±0.2 3 2)4)

3 讨论

抑郁症在中中医学中属于于“郁证”的范范畴,为狭义义之郁郁,即情志之郁郁,其病位主要要在脑,涉及心、肝、脾、肾等等脏腑。脑为元神之府,主主司人的思维、、意识和情志志活动动,脑神失用是是抑郁症的主主要病机。百会会为督脉之穴穴位,位于巅顶,为为手足三阳经经、督脉与肝经经之交会穴,针灸灸百会可宣畅畅气机、疏通经经脉、鼓舞阳阳气以达宣阳开郁郁之效[10]。印堂堂穴虽为经外外奇穴,但位于于督脉循行线线上,又为“上丹田田”,乃藏神之之所,具有醒神神调神、镇静静安神神 之效[11]。百百会与印 堂配伍伍应用 可宣阳阳开郁、通督督启神神,两穴为治疗疗抑郁症的常常用穴位。

近年来,随着着对抑郁症的的研究不断深入,诸多学者者越来来越意识到突突触可塑性损伤伤在抑郁症发发病中的重要要作用用。突触可塑性性指突触传递递效能的可调节性,其有两两种表表现形式,分别为长长时程增强强(long-termm potentiation,LTP)、长时程抑制制(long-termm deppression, LTTD)。抑郁状态态下常伴有LLTP和LTD的的改变变,前额叶锥体体细胞突触可可塑性的LTP、、LTD改变尤尤为明明显[12]。有研研究[13]表明抑郁郁症发病与内内侧前额叶皮皮层内内谷氨酸能系系统的激活有关关。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异 恶 唑唑 丙 酸 受 体体 (α-amino-3-hydroxy--5-mmethyl-4-isooxa-zoleproppionic acidd receptor,AMPPAR)是离子型型谷氨酸受体之之一,GLUR1作作为AMPAR的的一个个重要亚基,增增加其在突触触膜上的插入,可以使突触触传递递效率增强,对对于突触可塑塑 性和空间记记忆 的保留具具有重重要意义[14-15]。GLUR1在突触触可塑性LTPP的诱导过程程中扮扮演着十分重重要的角色,CCa2﹢浓度下降降后,钙/钙调调素依依赖蛋白激酶酶-Ⅱ(CaMKⅡ)依然具有较较长时间的活活性,可以作用于GGLUR1亚基的的磷酸化,调节节AMPAR受体体在突突触后膜的移移动,增强AMPPAR单通道传导作用。但是是在敲敲除了GLUR1基因的动物中中,尽管AMPARR的传导作用依然存在,然而 LTP却不能被诱导发生。因此,GLUR1在 Ca MKⅡ介导下对于诱导 LTP的产生具有重要作用[16]。NMDA受体亦是离子型谷氨酸受体之一,在中枢神经系统中广泛分布,在突触可塑性调控中发挥重要作用[17]。其中,NR2B亚基作为NMDA受体的调节亚基与抑郁症的发病关系密切[18-19]。NR2B主要分布于前额叶、海马等前脑区,与学习、记忆、情绪调节等紧密相关[20]。NR2B亚基表达不足或过度表达均可导致认知功能、情绪调节障碍,引发中枢神经系统疾病,如抑郁症。研究表明,NR2B亚基高水平表达能够促使大量NMDA受体激活,进而使 cAMP反应元件结合蛋白得以激活,以产生更强、更稳定的LTP,LTP的形成又能够上调NR2B的表达水平,从而增强学习、记忆等功能[21]。本实验结果发现,电针可明显改善抑郁样大鼠行为学症状,同时,电针治疗可以在一定程度上调抑郁样大鼠前额叶皮质内GLUR1、NR2B蛋白表达水平,提示电针可能通过上调WKY大鼠前额叶皮质内GLUR1、NR2B表达水平从而改善其突触可塑性而发挥抗抑郁作用。

WKY大鼠是当前运用较为广泛的抑郁动物模型,ALEKSANDROVALR等[22]认为WKY大鼠在行为学方面表现为体质量下降,旷场实验中总运动量减少、中心运动时间减少,主动回避行为增加,蔗糖摄入量减少,强迫游泳实验静止时间增加,对新异物体识别能力降低,与临床中抑郁患者快感缺乏、兴趣降低、认知功能受损、求生欲下降的特点较为相符,且WKY作为内源性抑郁模型,先天对应激敏感,具有抑郁易感性,对临床中常用的经典抗抑郁药,如氟西汀、文法拉辛、西酞普兰、地帕西明、丙咪嗪等均产生耐药,此模型有助于揭示新的抗抑郁靶点,即突触可塑性在抑郁症中发挥的作用。佘燕玲等[23]在研究中发现电针可改善WKY大鼠抑郁样行为和海马超微结构。也有研究[24-25]表明,电针对WKY大鼠抑郁样症状有明显改善,可提高海马和僵核内GLUR1蛋白表达量,为电针调节抑郁大鼠突触可塑性提供了有效依据。

综上,采用电针干预 WKY抑郁大鼠可以较好地改善其抑郁样症状,可能通过上调前额叶皮质 GLUR1、NR2B蛋白表达从而改善其突触可塑性,来达到治疗抑郁症的目的。