炮制和煎煮方式对化痰祛湿活血方成分的影响Δ

刘鸣昊，黄亚森，张振凌，张丽慧，刘素彤，赵文霞#（.河南中医药大学第一附属医院脾胃肝胆病科，郑州 450006；.河南中医药大学药学院，郑州 450046）

化痰祛湿活血方（Huatan qushi huoxue decoction，HQHD）是由全国第五批名老中医赵文霞教授根据非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）病机“痰湿内停、淤血阻滞、肝失条达”而定的经验方，由泽泻（30 g）、丹参（15 g）、郁金（15 g）、海藻（15 g）、决明子（10 g）、山楂（15 g）、水飞蓟（15 g）、柴胡（6 g）共8味中药组成。方中泽泻利水渗湿、行气消瘀，为君药；丹参活血化瘀、凉血安神，郁金活血止痛、行气解郁，海藻化痰利湿、软坚消痰，共为臣药；决明子清肝明目，山楂消积散瘀，水飞蓟清热解毒，共为佐药；柴胡疏肝理气，为使药；全方共奏化痰祛湿活血之功。目前，该方已被开发为院内制剂消脂护肝胶囊（豫药制字Z20130331[郑]），用于临床治疗NASH，效果良好[1]。

本课题组通过查阅文献发现，决明子长于清肝热，炮制前后均可减轻肝损伤，降低丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平，且生品活性强于炮制品[2]；山楂生品和炮制品的降脂效果存在差异，以净山楂最优[3]；泽泻经麸炒后寒性稍微，长于渗湿和脾、降浊以升清，利尿作用较生品显著增强，主要活性成分23-乙酰泽泻醇B的含量较生品有所升高[4]；丹参经酒炙后，寒凉之性缓和，活血祛瘀、调经止痛之功增强[5]；郁金能够引药入血，且醋郁金在止痛方面的作用最强[6]；醋柴胡可引药入肝，疏肝解瘀止痛效果强于生品[7]。另外，有研究分析了传统汤剂单煎与混煎的化学成分和药效学指标的异同，发现复方混煎和药味单煎混合汤剂在化学成分、药效和临床应用上均各有不同[8-10]。可见，炮制方法和煎煮方式均会影响单味药材及全方的功效。HQHD原方中，各味药材均采用生品，而未选用活性更优的泽泻、丹参、郁金、柴胡炮制品，目前也尚无研究探讨HQHD单煎与混煎对药材有效成分溶出的影响。

中药成分复杂，检测任一种或多种活性成分均不能表征其整体质量，故质量一致性成为中药质量控制的难点。目前，中药指纹图结合高效液相色谱（HPLC）法已成为中药质量控制的主要手段[11-12]。本课题组前期采用正交实验优化了HQHD标准汤剂的煎煮工艺，得其最优煎煮工艺为12倍量水、浸润60 min、煎煮30 min×3次。在此基础上，本研究拟建立以生品或炮制品及不同煎煮方式所得HQHD样品的指纹图谱，并进行相似度评价；同时，拟结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）等化学模式识别方法，分析各批次样品的成分差异，以期为完善HQHD质量标准、实现后续相关制剂的质量控制提供依据，也为HQHD中各药味的炮制及煎煮方式的进一步优化提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括1260型HPLC仪（美国Agilent公司）、BSA224S-CWⅠ级电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]、YP10002Ⅲ级电子天平（上海衡际科学仪器有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

芦丁、橙皮苷、丹酚酸B、槲皮素、水飞蓟宾、木犀草素、橙黄决明素、23-乙酰泽泻醇C、柴胡皂苷b2对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司，批号分别为153-18-4、520-26-3、121521-90-2、522-12-3、802918-57-6、327-97-9、67979-25-3、26575-93-9、58316-41-9，纯度均不低于98.0%。

泽泻饮片（批号分别为200403641、200202011、200500691）、丹参饮片（批号分别为 201200631、201100181）、柴胡饮片（批号分别为 200403321、200900911）、山楂饮片（批号分别为 210102511、191203831、190804891）、决明子饮片（批号分别为191000099、190200099）、郁金饮 片（批号分别为201201391、191001211）、海藻饮片（批号190601871）均购自康美药业股份有限公司；郁金饮片（批号200502）购自普宁市泽群中药饮片有限公司；海藻饮片（批号200801）购自广东天诚中药饮片有限公司；水飞蓟饮片（批号190501CP0122）购自安国市光明饮片加工厂。上述饮片由河南中医药大学药学院张振凌教授鉴定均为真品，且符合2020年版《中国药典》（一部）规定。

黄酒（批号20160909，酒精度≥10.0%）购自湖州老恒和酿造有限公司；米醋（批号20201022）购自山西紫林醋业股份有限公司；麦麸购自南阳市新田园农产品有限公司；甲醇、磷酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 饮片炮制

2.1.1 麸炒泽泻 大火预热待烟起时，将麦麸快速均匀撒入热锅中，改中火加热，快速投入提前净制且大小分档的泽泻片快速翻炒，炒至泽泻表面呈黄色、麦麸呈焦黄色时出锅，筛去麦麸，晾凉。每100 kg泽泻用麦麸10 kg。

2.1.2 酒丹参 取丹参片，照2020年版《中国药典》（四部）“0213炮制通则”项下酒炙法炒干[13]。每100 kg丹参用黄酒20 kg。

2.1.3 醋郁金 取郁金片净制，大小分档，加入规定剂量的米醋搅拌均匀，闷润，待醋被吸尽后，置铁锅内，用文火加热并快速翻炒，控制温度在200℃左右，炒干，取出晾凉，筛去碎屑。每100 kg郁金用米醋10 kg。

2.1.4 醋柴胡 取柴胡片，照2020年版《中国药典》（四部）“0213炮制通则”项下醋炙法炒干[13]。每100 kg柴胡用米醋20 kg。

2.2 色谱条件

以Eclipse XDS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，5.0%A→8.0%A；5～7 min，8.0%A；7～25 min，8.0%A→39.0%A；25～32 min，39.0%A→41.5%A；32～36 min，41.5%A；36～55 min，41.5%A→48.0%A；55～65 min，48.0%A→67.4%A；65～75 min，67.4%A→95.0%A；75～77 min，95.0%A→5.0%A；77～80 min，5.0%A）；柱温为35℃；流速为0.9 mL/min；检测波长为265 nm；进样量为10 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液 分别精密称取芦丁、橙皮苷、丹酚酸B、槲皮素、水飞蓟宾、木犀草素、橙黄决明素、23-乙酰泽泻醇C、柴胡皂苷b2对照品各适量，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得上述成分质量浓度分别为0.322、0.145、0.243、0.128、0.998、0.516、0.165、0.161、0.112 mg/mL的单一对照品储备液。分别吸取上述对照品储备液100、200、100、200、20、50、200、200、200 μL 置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3.2 HQHD供试品溶液 将不同批号的8味饮片随机组合成10个不同批次的HQHD样品（编号S1～S10），其中各批次原方混煎（编号YH-1～YH-10）、原方单煎（编号YD-1～YD-10）、炮制混煎（编号PH-1～PH-10）、炮制单煎（编号PD-1～PD-10）样品的饮片组成及来源同相应批次的HQHD样品，具体批号见表1。

表1 10批HQHD样品中各饮片的批号信息

按处方量精密称定各饮片，混合，放入锅中，按本课题组前期所得最优工艺煎煮，水煎液于50℃下浓缩至400 mL，取10 mL于25 mL量瓶中，用75%甲醇定容，摇匀，滤过，续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得原方混煎供试品溶液。按处方量分别精密称定与上述样品等量的饮片，分置于烧杯中，按上述最优工艺煎煮，混合各水煎液，于50℃下浓缩至400 mL，取10 mL于25 mL量瓶中，用75%甲醇定容，摇匀，滤过，续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得原方单煎供试品溶液。取泽泻、丹参、郁金、柴胡炮制品，其余药材取生品，按上述原方混煎供试品方法制备炮制混煎供试品溶液，按上述原方单煎供试品方法制备炮制单煎供试品溶液。

2.3.3 HQHD单味饮片供试品溶液及阴性溶液 按处方量精密称取泽泻、丹参、郁金、柴胡、山楂、海藻、决明子、水飞蓟饮片，按“2.3.2”项下方法制得HQHD各单味饮片供试品溶液和分别缺泽泻、郁金、水飞蓟、山楂、决明子、海藻、丹参、柴胡的阴性溶液。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验 取同一HQHD供试品溶液（YH-1），按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录HPLC图。以丹酚酸B峰（保留时间适中，峰面积较大且分离度良好）为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.04%（n＝6），相对峰面积的RSD为1.04%～2.69%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一HQHD供试品溶液（YH-1），置于HPLC仪进样盘中，分别在放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图。以丹酚酸B峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.04%（n＝6），相对峰面积的RSD为0.52%～1.83%（n＝6），表明供试品溶液在该条件下放置24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 按“2.3.2”项下方法制备HQHD供试品溶液（YH-1），共6份，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图。以丹酚酸B峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.09%（n＝6），相对峰面积的RSD为1.12%～3.29%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.4.4 HPLC指纹图谱的建立 取“2.3.2”项下HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎各10个批次的供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图。将所得图谱信息导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以各类样品的首批图谱（色谱峰分离度好且出峰稳定）为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1 min，采用中位数生成法进行多点校正和全谱峰匹配，生成HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎的叠加指纹图谱及相应的对照指纹图谱（R），见图1。由图1可知，HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品的叠加指纹图谱均各有37个共有峰。通过匹配分离度较好的共有峰获得共有峰模式（图2A），通过比对混合对照品溶液的HPLC图（图2B），共指认出9个共有峰：12号峰为芦丁、13号峰为橙皮苷、16号峰为丹酚酸B、20号峰为槲皮素、22号峰为水飞蓟宾、23号峰为木犀草素、29号峰为橙黄决明素、34号峰为23-乙酰泽泻醇C、35号峰为柴胡皂苷b2。

图1 10批HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品的叠加指纹图谱和对照指纹图谱

图2 共有峰模式和混合对照品溶液的HPLC图

2.4.5 共有峰归属 取HQHD原方混煎样品（YH-1）和泽泻、丹参、郁金、柴胡、山楂、海藻、决明子、水飞蓟单味饮片，分别按“2.3.2”“2.3.3”项下方法制备供试品溶液和各阴性溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图。通过与色谱峰的保留时间和紫外吸收图进行对比分析，初步对37个共有峰进行了归属，见图3。由图3可知，8味组方饮片对HQHD指纹图谱均有贡献，其中1号峰来自海藻、水飞蓟、泽泻、丹参，2号峰来自山楂、泽泻、水飞蓟、丹参，3、8号峰来自山楂，4号峰来自山楂、丹参、水飞蓟，5号峰来自山楂、水飞蓟，6号峰来自海藻、山楂、郁金，7号峰来自柴胡、丹参、水飞蓟，9号峰来自泽泻、水飞蓟、山楂，10、11、12、18、36号峰来自决明子、丹参，13号峰来自柴胡、丹参、山楂，14号峰来自水飞蓟、丹参，15号峰来自水飞蓟、决明子、丹参，16、19号峰来自丹参，17、20、21、24～29、32号峰来自决明子，22号峰来自水飞蓟，23号峰来自决明子、水飞蓟，30号峰来自水飞蓟、郁金，31、34号峰来自泽泻，33号峰来自决明子、泽泻，35号峰来自柴胡，37号峰来自丹参、决明子。

图3 HQHD共有峰归属

2.4.6 相似度分析 将HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品的图谱依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，采用多点校正和Mark峰匹配计算相似度。结果，与对照指纹图谱比对，10批原方混煎样品的相似度为0.962～0.999，10批原方单煎样品的相似度为0.975～0.998，10批炮制混煎样品的相似度为0.943～0.998，10批炮制单煎样品的相似度为0.953～0.995，均在0.950以上，表明样品相似度良好，所建HQHD指纹图谱稳定、可靠，可以反映样品的特征。

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 PCA 以10批HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品指纹图谱37个共有峰的峰面积为变量，用SIMCA-P 14.1（Demo）软件的“Pareto”功能进行预处理，经系统自动拟合后选取前2个主成分进行分析，其中第1个主成分的贡献率为44.9%，第2主成分的贡献率为19.1%；模型检验参数R2Xcum（模型对X矩阵的解释率）为0.639，模型预测参数Q2cum（原始模型预测能力）为0.514，表明该模型稳定性及预测信度良好[14]。据PCA得分图（图4）可知，原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品各自聚为一类。

图4 PCA得分图

2.5.2 炮制前后、不同煎煮方式的HQHP镜像对比 随机选取4批炮制前后、不同煎煮方式的HQHP样品的HPLC图进行镜像比较，未发现新成分（图略）。

2.5.3 PLS-DA 在PCA的基础上，以10批HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品指纹图谱37个共有峰的峰面积为变量，用SIMCA-P 14.1（Demo）软件进行有监督模式的PLS-DA，得模型检验参数R2Xcum为0.639、R2Ycum（模型对Y矩阵的解释率）为0.626，模型预测参数Q2cum为0.601，说明样品分离良好[14]。据PLS-DA得分图（图5）可知，原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品各自聚为一类，与PCA分析结果一致。

图5 PLS-DA得分图

2.5.4 差异标志物分析 为分析引起样品差异的原因和差异标志物，本研究将不同批次HQHD原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品指纹图谱37个共有峰的峰面积输入SIMCA-P 14.1（Demo）软件，建立有监督模式的PLS-DA模型。为验证所建PLS-DA模型是否存在过度拟合现象，设置分类矩阵变量随机排列200次以进行置换检验，结果R2拟合线和Q2拟合线与Y坐标轴的截距均分别小于0.3和0.05，说明所建模型可靠，不存在过度拟合现象，可用以判别分析组间差异[15]。

为确定影响样品质量的差异标志物，本研究采用变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）对数据矩阵进行分析，VIP图见图6。当VIP＞1时，代表对应成分对样品质量具有显著影响，是潜在的差异标志物[14]。由图6A可知，1、15、17、18、36号峰对应成分和丹酚酸B（16号峰）、木犀草素（23号峰）可能是影响原方混煎与炮制混煎样品质量的差异标志物；由图6B可知，1、7、17～19号峰对应成分和丹酚酸B（16号峰）、橙皮苷（13号峰）可能是影响原方单煎与炮制单煎样品质量的差异标志物；由图6C可知，1、17～19、36号峰对应成分和丹酚酸B（16号峰）、木犀草素（23号峰）可能是影响原方单煎与原方混煎样品质量的差异标志物；由图6D可知，7、17～19、21号峰对应成分和橙皮苷（13号峰）、丹酚酸B（16号峰）、芦丁（12号峰）、木犀草素（23号峰）、橙黄决明素（29号峰）可能是影响炮制混煎与炮制单煎样品质量的差异标志物。

图6 共有峰的VIP图

3 讨论

本研究建立了不同批次HQHD样品的指纹图谱，通过相似度评价发现，各类样品与对照指纹图谱的相似度均大于或接近于0.950，表明各批次样品的整体质量稳定可靠。本研究共标记了37个共有峰；通过与混合对照品比对，共指认了9个共有峰；进一步通过色谱峰的镜像分析可知，炮制前后、不同煎煮方式的HQHD均未发现新成分，但峰面积有所变化，提示炮制和煎煮方式可能对化学成分的含量有所影响。

PCA结果发现，原方混煎、原方单煎、炮制混煎、炮制单煎样品各自聚为一类，说明各类样品间存在差异，炮制和煎煮方式的影响较大。进一步对两组组成相同、煎煮方式不同的原方单煎和原方混煎、炮制单煎和炮制混煎样品进行PLS-DA发现，1、17～19、36号峰对应成分和丹酚酸B、木犀草素可能是原方混煎和原方单煎样品的差异标志物（图6C），7、17～19、21号峰对应成分和橙皮苷、丹酚酸B、芦丁、木犀草素、橙黄决明素可能为炮制混煎与炮制单煎样品的差异标志物（图6D），提示1、7、21、36号峰对应成分和橙皮苷、芦丁、橙黄决明素7个成分可能是HQHD样品质量的差异性成分。结合指纹图谱结果可知，炮制后上述成分的峰面积均显著增加，且单煎大于混煎，可能与炮制过程中的成分转化、分解、物理结构改变及辅料作用等有关。

进一步对两组煎煮方式相同、组成不同的原方混煎和炮制混煎、原方单煎和炮制单煎样品进行PLS-DA发现，1、15、17、18、36号峰对应成分和丹酚酸B、木犀草素可能为原方混煎与炮制混煎样品的差异标志物（图6A），1、7、17～19号峰对应成分和丹酚酸B、橙皮苷可能为原方单煎与炮制单煎样品的差异标志物（图6B），提示7、15、19、36号峰对应成分和木犀草素、橙皮苷6个成分可能是影响HQGD样品质量的差异性成分。结合指纹图谱结果可知，炮制后单煎样品中上述成分的峰面积均显著增加，可能与不同的煎煮方式会通过改变溶剂的pH、黏度和溶质的旋光度、渗透压、荷电情况等属性来影响成分的溶解度，或与其他溶质发生相互作用而导致成分水溶性递减等因素有关。但1、7、15、19、21、36号峰对应成分还需借助高分辨质谱、核磁共振等技术进行鉴定。

在NASH发病过程中，首先是各种原因造成的肝脏内脂肪酸增多，多余的游离脂肪酸与甘油发生酯化反应生成三酰甘油，导致肝脏脂肪堆积；随后在脂肪的浸润下，肝细胞更易受到脂肪因子和氧化应激等因素的打击，从而发生损伤，最终发展为NASH[16]。此外，肝脏脂肪堆积也与总胆固醇水平密切相关：总胆固醇与低密度脂蛋白结合后可被肝细胞排出；当该过程发生障碍时，大量的总胆固醇在肝脏中堆积，从而引起肝脏脂肪变性[17]。有研究指出，芦丁能够激活脂肪变性人肝细胞HepG2中过氧化物酶体增殖物激活受体α的转录和翻译，进而促进其靶因子肉毒碱棕榈酰转移酶的转录，加速脂肪酸的降解代谢，抑制三酰甘油的合成，提示该成分对非酒精性脂肪性肝病具有一定的治疗作用[18]；橙皮苷可通过抗脂质过氧化对肝纤维化大鼠发挥保护作用[19]；橙黄决明素可通过调节脂肪酸的代谢来发挥较强的调脂作用，从而降低大鼠总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平，提高高密度脂蛋白水平[20]。基于上述文献，笔者推测上述成分在炮制、煎煮过程中的变化可能会导致HQHD药效的改变，但仍需后续研究予以验证。

综上所述，本文所建HQHD指纹图谱方法稳定、可靠；木犀草素、橙皮苷等是不同煎煮方式样品的质量差异成分，芦丁、橙皮苷、橙黄决明素等是炮制与否样品的质量差异成分。本实验结果能较为全面地探讨炮制和煎煮方式对HQHD的影响，但中药复方化学成分复杂，本研究仅对共有峰进行了初步分析，后期可加强对其他未知差异性成分的识别，并跟踪其体内代谢过程，通过比较入血成分含量、组织分布、代谢等情况探讨炮制和煎煮方式对中药复方体内行为的影响，以期为中药炮制理论、临床药效提供更多依据。