参附注射液化学成分鉴定及其炔醇类化合物的抗炎活性研究Δ

郑 琪，王晓雅，刘 杰，彭 成，熊 亮，朱雅宁，周勤梅，3#[.成都中医药大学药学院/省部共建西南特色中药资源国家重点实验室，成都 637；2.成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所，成都 637；3.成都中医药大学中医药创新研究院，成都 637；.华润三九（雅安）药业有限公司，四川雅安 625000]

研究表明，心血管疾病与炎症密切相关，动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭和心肌病等的发病过程都有炎症因子的参与[1]。参附注射液是临床上常用的中成药，常用于血管性疾病的治疗，如心力衰竭、心律失常、休克、缺血再灌注损伤、心肌梗死、脑梗死、血管性痴呆、缺血缺氧性脑病、血栓闭塞性脉管炎、下肢深静脉血栓等[2]。目前关于参附注射液的化学成分研究主要集中于对参附注射液中的化学成分进行分析及鉴定[3-5]，或对其中主要成分人参皂苷进行含量测定[6-8]。为进一步明确参附注射液的药效物质基础，本课题组对参附注射液开展了系统研究，采用大孔吸附树脂、中压液相色谱、制备薄层色谱和反相半制备高效液相色谱等方法进行分离纯化，从参附注射液中分离鉴定出12个化合物，并对其中的炔醇类化合物进行了抗炎活性研究，现报道如下。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Bruker-600型核磁共振（NMR）波谱仪、离子淌度质谱仪（德国Bruker公司），Synapt G2 HDMS型高分辨质谱仪（美国Waters公司），LTQ-XL型线性离子阱质谱仪、SeriesⅡWater Jacketed型CO2孵箱（美国Thermo Fisher Scientific公司），1220型半制备型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Power-Pac Basic型基础电泳仪（美国Bio-rad公司），Tanon 5200型显影仪（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

参附注射液提取物（批号18100361002）购自华润三九（雅安）药业有限公司。柱层析硅胶（批号2202173，规格200～300目）购自青岛海浪硅胶干燥剂厂；脂多糖（批号0000114327）购自美国Sigma公司；一氧化氮试剂盒（批号070821220411）购自南京建成生物工程研究所；DMEM培养基（批号8122126）购自美国Gibco公司；超灵敏化学发光检测试剂盒（批号4AE242220FGE）购自北京四正柏生物科技有限公司；兔源β-actin抗体（批号GTX19639）购自美国GeneTex公司；兔源环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抗体（批号AF1924）购自上海碧云天生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）（批号219761108）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验细胞

RAW264.7细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

以参附注射液提取物（260 g）为原料，经D101大孔吸附树脂上样吸附，依次用纯水和10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，得到不同乙醇洗脱部位（A～F）。D部位（12.6 g）经中压液相色谱分离，用甲醇-水（甲醇30%→80%）进行梯度洗脱，得到5个馏分（D1～D5），其中D2有粉末析出；采用反相半制备液相色谱对该粉末进行分离，用乙腈-水（乙腈30%→70%）进行梯度洗脱，制备得到化合物1（8.5 mg）、化合物2（12.2 mg）和化合物3（11.0 mg）。E部位（18.0 g）经中压液相色谱分离，用甲醇-水（甲醇50%→100%）进行梯度洗脱，通过薄层色谱检视，合并相似流分，减压浓缩，最后得到12个流分（E1～E12）。取E3（58.0 mg）经反相半制备液相色谱，以乙腈-水（20∶80，V/V）为流动相分离得到化合物7（1.2 mg）。取E4（251.0 mg）经反相制备液相色谱，以甲醇-水（70∶30，V/V）为流动相分离得到化合物9（1.2 mg）。取E7（428.0 mg）经反相制备液相色谱，以甲醇-水（87∶13，V/V）为流动相分离得到6个流分（E7-1～E7-6）。其中E7-2经反相制备液相色谱，以乙腈-水（80∶20，V/V）为流动相分离得到5个流分（E7-2-1～E7-2-5）；E7-2-2和E7-2-5进一步通过反相半制备液相色谱，分别以乙腈-水（70∶30，V/V）和乙腈-水（68∶32，V/V）为流动相分离得到化合物11（1.4 mg）和化合物12（2.2 mg）。E7-6通过反相半制备液相色谱，以乙腈-水（72∶28，V/V）为流动相制备得到化合物10（2.1 mg）。E11（162.0 mg）经反相制备液相色谱，以甲醇-水（90∶10，V/V）为流动相分离得到3个流分（E11-1～E11-3）；E11-1进一步通过反相半制备液相色谱，以乙腈-水（70∶30，V/V）为流动相分离得到化合物4（1.1 mg）；E11-3经反相半制备液相色谱，以乙腈-水（72∶28，V/V）为流动相不断纯化得到化合物5（2.5 mg）和化合物6（2.3 mg）。E12（47.0 mg）经制备薄层色谱和反相半制备液相色谱，分别以二氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）和甲醇-水（90∶10，V/V）为流动相分离得到化合物 8（3.4 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：白色粉末。高分辨电喷雾离子化质谱（HR-ESI-MS）显示质荷比（m/z）为823.481 7[M+Na]+（计算值823.482 0，C42H72NaO14），推测化合物的分子式为C42H72O14。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH2.10（3H，s，H3-28），1.64（3H，s，H3-21），1.61（3H，s，H3-26或H3-27），1.62（3H，s，H3-26或H3-27），1.60（3H，s，H3-29），1.18（3H，s，H3-18），1.06（3H，s，H3-19），0.83（3H，s，H3-30）；2个糖端基质子信号：δH5.20（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″），5.06（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1′）；1个烯氢信号：δH5.26（1H，t，J＝7.2 Hz，H-24）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.8（C-1），28.3（C-2），79.0（C-3），40.7（C-4），61.7（C-5），80.1（C-6），45.5（C-7），41.5（C-8），50.4（C-9），40.0（C-10），31.3（C-11），70.5（C-12），49.5（C-13），51.7（C-14），31.0（C-15），27.0（C-16），51.8（C-17），18.1（C-18），17.9（C-19），83.6（C-20），22.6（C-21），36.5（C-22），23.5（C-23），126.3（C-24），131.3（C-25），26.1（C-26），18.1（C-27），32.1（C-28），16.7（C-29），17.5（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（106.3，75.8，80.5，72.2，78.6，63.4），20-Glc-C-1″～20-Glc-C-6″（98.6，75.5，79.8，72.0，78.7，63.3）。以上数据与文献[9]报道的人参皂苷Rg1一致。

化合物2：白色粉末。HR-ESI-MS显示m/z为969.538 1[M+Na]+（计算值969.539 9，C48H82NaO18），推测化合物的分子式为C48H82O18。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH2.15（3H，s，H3-28），1.62（3H，s，H3-21），1.61（3H，s，H3-26），1.61（3H，s，H3-27），1.39（3H，s，H3-29），1.20（3H，s，H3-18），0.99（3H，s，H3-19），0.98（3H，s，H3-30）；3个糖端基质子信号：δH6.54（1H，br s，H-1″），5.30（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1′），5.20（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1″′）；1个Rha的甲基质子信号：δH1.80（3H，d，J＝6.6 Hz，H3-6″）；1个烯氢信号：δH5.26（1H，t，J＝6.6 Hz，H-24）；1个苷元部分特征质子信号：δH1.42（1H，d，J＝10.8 Hz，H-5α）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.4（C-1），27.8（C-2），78.7（C-3），40.4（C-4），61.2（C-5），78.3（C-6），46.3（C-7），41.6（C-8），49.9（C-9），40.0（C-10），31.3（C-11），70.5（C-12），49.5（C-13），51.8（C-14），31.1（C-15），27.0（C-16），52.0（C-17），17.9（C-18），18.0（C-19），83.6（C-20），22.6（C-21），36.4（C-22），23.6（C-23），126.4（C-24），131.2（C-25），26.1（C-26），18.1（C-27），32.6（C-28），17.7（C-29），17.6（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（102.2，79.8，78.7，72.7，78.9，63.4），2′-Rha-C-1″～2′-Rha-C-6″（102.3，72.8，72.9，74.6，69.9，19.1），20-Glc-C-1″′～20-Glc-C-6″′（98.6，75.5，79.7，72.0，78.7，63.3）。以上数据与文献[9]报道的人参皂苷Re一致。

化合物3：白色粉末。HR-ESI-MS显示m/z为1 131.591 2[M+Na]+（计算值 1 131.592 7，C54H92NaO23），推测化合物的分子式为C54H92O23。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH1.67（3H，s，H3-26或H3-27），1.68（3H，s，H3-26或H3-27），1.61（3H，s，H3-21），1.30（3H，s，H3-28），1.12（3H，s，H3-29），0.97（3H，s，H3-18或 H3-30），0.98（3H，s，H3-18 或 H3-30），0.83（3H，s，H3-19）；4个糖端基质子信号：δH5.40（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″），5.16（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″′），5.13（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1″），4.95（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1′）；1个烯氢信号：δH5.32（1H，t，J＝7.2 Hz，H-24）；1个苷元部分特征质子信号：δH0.67（1H，d，J＝12.0 Hz，H-5α）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中 δC：39.5（C-1），27.1（C-2），89.3（C-3），40.4（C-4），56.7（C-5），18.8（C-6），35.5（C-7），40.0（C-8），50.6（C-9），37.2（C-10），31.2（C-11），70.6（C-12），49.9（C-13），51.9（C-14），31.0（C-15），27.0（C-16），51.7（C-17），16.6（C-18），16.4（C-19），83.8（C-20），22.7（C-21），36.5（C-22），23.6（C-23），126.3（C-24），131.4（C-25），26.2（C-26），18.3（C-27），28.5（C-28），17.0（C-29），17.8（C-30），3-Glc-C-1′～3-Glc-C-6′（105.8，83.9，78.3，72.0，78.5，63.0），2′-Glc-C-1″～2′-Glc-C-6″（106.5，77.6，78.7，72.0，78.7，63.2），20-Glc-C-1″′～20-Glc-C-6″′（98.5，75.2，78.8，71.9，77.5，70.5），6″′-Glc-C-1″″～6″′-Glc-C-6″（105.6，75.6，78.8，71.9，79.6，63.4）。以上数据与文献[9]报道的人参皂苷Rb1一致。

化合物4：白色无定形粉末。HR-ESI-MS显示m/z为789.475 4[M+Na]+（计算值789.476 5，C42H70NaO12），推测化合物的分子式为C42H70O12。1H-NMR（600 MHz，C5D5N）显示7个甲基质子信号：δH1.68（3H，s，H3-28），1.62（3H，s，H3-26），1.33（3H，s，H3-27），1.13（3H，s，H3-18），1.04（3H，s，H3-29），0.98（3H，s，H3-19），0.84（3H，s，H3-30）；2个糖端基质子信号：δH5.41（1H，d，J＝7.8 Hz，2′-Glc-H-1″），4.96（1H，overlapped，3-Glc-H-1′）；3个烯氢信号：δH5.31（1H，t，J＝7.2 Hz，H-24），5.17（1H，br s，H-21b），4.93（1H，br s，H-21a）；1个连氧次甲基信号：δH3.96（1H，m，H-12）；2个苷元部分特征质子信号：δH3.31（1H，dd，J＝13.2、5.4 Hz，H-3），0.70（1H，br d，J＝11.4 Hz，H-5）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）中δC：39.7（C-1），26.2（C-2），89.4（C-3），40.2（C-4），56.9（C-5），18.9（C-6），35.8（C-7），40.6（C-8），48.8（C-9），37.5（C-10），32.5（C-11），72.1（C-12），53.0（C-13），51.7（C-14），31.2（C-15），27.5（C-16），51.3（C-17），17.1（C-18），17.4（C-19），156.0（C-20），108.6（C-21），34.3（C-22），27.2（C-23），125.8（C-24），131.7（C-25），26.2（C-26），18.2（C-27），28.6（C-28），16.3（C-29），17.0（C-30），3-Glc-C-1′～3-Glc-C-6′（105.6，84.0，78.8，72.1，78.4，63.2），2′-Glc-C-1″～2′-Glc-C-6″（106.6，77.7，78.8，72.9，78.6，63.3）。以上数据与文献[4]报道的人参皂苷Rk1一致。

化合物5：白色无定形粉末。HR-ESI-MS显示m/z为661.427 9[M+Na]+（计算值661.429 2，C36H62NaO9），推测化合物的分子式为 C36H62O9。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH2.12（3H，s，H3-28），1.71（3H，s，H3-26），1.66（3H，s，H3-27），1.65（3H，s，H3-29），1.42（3H，s，H3-21），1.27（3H，s，H3-18），1.09（3H，s，H3-19），0.89（3H，s，H3-30）；7个糖端基质子信号：5.09（1H，d，J＝7.8 Hz，6-Glc-H-1′），4.57（1H，br d，J＝11.4 Hz，6-Glc-H-6′a），4.41（1H，dd，J＝11.4、5.4 Hz，6-Glc-H-6′b），4.27（1H，m，6-Glc-H-3′），4.14（1H，t，J＝7.8 Hz，6-Glc-H-4′），4.00（1H，m，6-Glc-H-2′），3.95（1H，m，6-Glc-H-5′）；1个烯氢信号：δH5.32（1H，m，H-24）；2个苷元部分特征质子信号：δH1.48（1H，d，J＝10.2 Hz，H-5），1.16（1H，t，J＝10.2 Hz，H-15b）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中 δC：39.9（C-1），28.4（C-2），79.0（C-3），40.9（C-4），61.9（C-5），80.5（C-6），45.7（C-7），41.6（C-8），50.7（C-9），40.1（C-10），32.7（C-11），71.4（C-12），49.4（C-13），52.2（C-14），31.8（C-15），27.1（C-16），51.1（C-17），17.9（C-18），18.2（C-19），73.5（C-20），23.2（C-21），43.7（C-22），23.1（C-23），126.5（C-24），131.2（C-25），26.3（C-26），18.2（C-27），32.2（C-28），16.9（C-29），17.5（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（106.5，76.0，80.2，72.3，78.7，63.6）。以上数据与文献[10]报道的20（R）-人参皂苷Rh1一致。

化合物6：白色无定形粉末。HR-ESI-MS显示m/z为807.485 7[M+Na]+（计算值807.487 1，C42H72NaO13），推测化合物的分子式为C42H72O13。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH1.67（3H，s，H3-26），1.64（3H，s，H3-27），1.44（3H，s，H3-21），1.33（3H，br s，H3-28），1.13（3H，s，H3-29），0.98（3H，s，H3-30），0.97（3H，s，H3-18），0.82（3H，s，H3-19）；2个糖端基质子信号：δH5.40（1H，d，J＝7.2 Hz，2-Glc-H-1″），4.58（1H，d，J＝10.2 Hz，1-Glc-H-1′）；1个烯氢信号：δH5.33（1H，m，H-24）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.6（C-1），27.2（C-2），89.4（C-3），40.2（C-4），56.8（C-5），18.9（C-6），35.6（C-7），40.5（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），32.5（C-11），71.5（C-12），49.1（C-13），52.2（C-14），31.8（C-15），27.3（C-16），55.3（C-17），16.3（C-18），16.8（C-19），73.4（C-20），27.6（C-21），36.4（C-22），23.5（C-23），126.8（C-24），131.2（C-25），26.3（C-26），17.5（C-27），28.6（C-28），17.1（C-29），18.1（C-30），3-Glc-C-1′～3-Glc-C-6′（105.6，84.0，78.8，72.1，78.8，63.3），2′-Glc-C-1″～2′-Glc-C-6″（106.6，77.7，78.6，72.1，78.4，63.2）。以上数据与文献[11]报道的20（S）-人参皂苷Rg3一致。

化合物7：白色无定形粉末。电喷雾离子化质谱（ESI-MS）显示 m/z为955.52[M+Na]+，综合其1D-NMR数据分析，推测其分子式为C47H80O18。1H-NMR（C5D5N，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH2.09（3H，s，H3-28），1.61（3H，s，H3-21），1.61（6H，s，H3-26 和 H3-27），1.49（3H，s，H3-29），1.15（3H，s，H3-18），0.98（3H，s，H3-19），0.81（3H，s，H3-30）；3个糖端基质子信号：δH5.20（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1″），4.95（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1′），4.95（1H，d，J＝7.8 Hz，H-1″′）；1个烯氢信号：δH5.55（1H，br s，H-24）。13C-NMR（C5D5N，150 MHz）中δC：39.9（C-1），28.3（C-2），79.3（C-3），40.1（C-4），61.8（C-5），80.0（C-6），45.4（C-7），41.6（C-8），79.8（C-9），40.7（C-10），31.1（C-11），70.6（C-12），49.7（C-13），51.9（C-14），31.4（C-15），27.1（C-16），51.9（C-17），18.0（C-18），17.6（C-19），83.7（C-20），22.8（C-21），36.6（C-22），23.6（C-23），126.5（C-24），131.4（C-25），26.2（C-26），18.2（C-27），32.2（C-28），18.0（C-29），17.2（C-30），6-Glc-C-1′～6-Glc-C-6′（104.0，80.6，79.3，72.2，80.4，63.4），2ʹ-Xyl-C-1″～2′-Xyl-C-5″（105.3，76.3，78.5，71.8，67.8），20-Glc-C-1′～20-Glc-C-6′（98.7，75.6，78.8，72.2，79.3，63.4）。以上数据与文献[12]报道的三七皂苷R1一致。

化合物8：白色无定形粉末。ESI-MS显示m/z为477.33[M+H]+，综合其1D-NMR数据分析，推测其分子式为C30H52O4。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）显示8个甲基质子信号：δH1.31（3H，s，H3-28），1.26（3H，s，H3-27），1.22（3H，s，H3-26），1.18（3H，s，H3-21），1.06（3H，s，H3-18），0.98（3H，s，H3-29），0.93（3H，s，H3-19），0.91（3H，s，H3-30）；3个连氧次甲基信号：δH4.11（1H，m，H-6），3.53（1H，m，H-12），3.18（1H，dd，J＝11.4、4.2 Hz，H-3）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δC：38.8（C-1），27.2（C-2），78.7（C-3），39.3（C-4），61.3（C-5），68.9（C-6），47.2（C-7），41.1（C-8），49.5（C-9），39.4（C-10），31.0（C-11），69.9（C-12），48.9（C-13），51.1（C-14），31.2（C-15），25.3（C-16），54.8（C-17），17.3（C-18），17.3（C-19），76.8（C-20），19.5（C-21），35.8（C-22），16.4（C-23），36.5（C-24），73.3（C-25），33.1（C-26），27.2（C-27），30.5（C-28），15.6（C-29），17.2（C-30）。以上数据与文献[13]报道的人参三醇一致。

化合物9：无色油状物。HR-ESI-MS显示m/z为301.177 2[M+Na]+（计算值301.178 0，C17H26NaO3），推测化 合 物 的 分 子 式 为 C17H26O3。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）显示3个烯氢质子信号：δH5.94（1H，ddd，J＝16.8、10.2、5.4 Hz，H-2），5.46（1H，dt，J＝16.8、1.2 Hz，H-1a），5.24（1H，dt，J＝10.2、1.2 Hz，H-1b）；3个连氧次甲基信号：δH4.92（1H，br d，J＝5.4 Hz，H-3），3.65（1H，m，H-9），3.59（1H，m，H-10）；2个亚甲基信号：δH1.50（2H，m，H2-11），2.58（2H，t，J＝6.0 Hz，H2-8）；1组脂肪族链信号：δH1.29（10H，m，H-12～H-16）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中 δC：117.2（C-1），136.3（C-2），63.5（C-3），75.0（C-4），71.0（C-5），66.6（C-6），78.3（C-7），25.7（C-8），72.3（C-9），73.2（C-10），33.7（C-11），25.1（C-12），29.7（C-13），29.4（C-14），31.9（C-15），22.8（C-16），14.2（C-17）。以上数据与文献[14]报道的（3R，9R，10R）-人参炔三醇一致。

化合物10：无色油状物，HR-ESI-MS显示m/z为283.164 1[M+Na]+（计算值283.167 4，C17H24NaO2），推测化 合 物 的 分 子 式 为 C17H24O2。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）显示3个烯氢质子信号：δH5.95（1H，ddd，J＝16.8、10.2、5.4 Hz，H-2），5.47（1H，br d，J＝16.8 Hz，H-1a），5.26（1H，br d，J＝10.2 Hz，H-1b）；3个连氧次甲基信号：δH4.93（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），3.14（1H，ddd，J＝9.6、5.4、4.2 Hz，H-9），2.96（1H，m，H-10）；2个连炔键的亚甲基信号：δH2.70（1H，dd，J＝18.0、6.0 Hz，H-8a），2.39（1H，dd，J＝18.0、7.2 Hz，H-8b）；1个末端甲基信号：δH0.88（3H，t，J＝7.2 Hz，H3-17）；2组脂肪族链信号：δH1.50（4H，m，H-11～H-12），1.32（8H，m，H-13～H-16）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中 δC：117.3（C-1），136.1（C-2），63.6（C-3），75.0（C-4），70.9（C-5），66.4（C-6），76.8（C-7），19.6（C-8），54.4（C-9），57.1（C-10），27.6（C-11），26.6（C-12），29.5（C-13），29.3（C-14），31.8（C-15），22.7（C-16），14.2（C-17）。以上数据与文献[15]报道的人参环氧炔醇一致。

化合物11：白色无定形粉末，HR-ESI-MS显示m/z为283.165 1[M+Na]+（计算值283.167 4，C17H24NaO2），推测化合物的分子式为 C17H24O2。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）显示5个烯氢质子信号：δH6.34（1H，dd，J＝15.6、5.4 Hz，H-9），5.96（1H，ddd，J＝17.4、10.2、5.4 Hz，H-2），5.77（1H，d，J＝15.6 Hz，H-8），5.48（1H，br d，J＝17.0 Hz，H-1b），5.27（1H，br d，J＝10.2 Hz，H-1a）；2个连氧次甲基信号：δH4.98（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），4.20（1H，m，H-10）；1个末端甲基信号：δH0.88（3H，t，J＝7.2 Hz，H3-17）；1组脂肪族链信号：δH1.28～1.64（12H，m，H-11～H-16）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δC：117.4（C-1），136.0（C-2），63.8（C-3），80.5（C-4），73.6（C-5），71.0（C-6），77.6（C-7），108.1（C-8），150.1（C-9），72.1（C-10），37.0（C-11），25.3（C-12），29.3（C-13），29.5（C-14），22.7（C-15），31.9（C-16），14.2（C-17）。以上数据与文献[16]报道的heptadeca-1，8-dien-4，6-diyne-3，10-diol一致。

化合物12：无色油状物。ESI-MS显示m/z为245.24[M+H]+，综合其1D-NMR数据分析，推测其分子式为C17H24O。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）显示5个烯氢质子信号：δH5.94（1H，ddd，J＝17.4、10.2、5.4 Hz，H-2），5.51（1H，m，H-10），5.47（1H，d，J＝17.4 Hz，H-1a），5.37（1H，m，H-9），5.24（1H，d，J＝10.2 Hz，H-1b）；1个连氧次甲基信号：δH4.91（1H，d，J＝4.8 Hz，H-3）；1个与双键相连的亚甲基信号：3.03（2H，d，J＝7.2 Hz，H2-8）；1个末端甲基信号：δH0.88（3H，t，J＝6.6 Hz，H3-17）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）中δC：117.1（C-1），136.2（C-2），63.7（C-3），74.3（C-4），71.4（C-5），64.1（C-6），80.4（C-7），17.8（C-8），122.0（C-9），133.2（C-10），27.3（C-11），29.3（C-12），29.3（C-13），29.3（C-14），31.9（C-15），22.8（C-16），14.2（C-17）。以上数据与文献[15]报道的人参炔醇一致。

2.3 炔醇类成分的抗炎活性研究

2.3.1 统计分析方法 实验结果以SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

2.3.2 细胞活力测定 用CCK-8法进行检测。为防止药物因具有细胞毒作用导致细胞死亡而产生假阳性结果，对药物是否具有杀死RAW264.7细胞的作用进行考察。将RAW264.7细胞置于96孔板中，调整细胞密度为5×104个/孔，设置空白组和给药组。在37 ℃、5%CO2条件下（后同）培养24 h，弃上清液，给药组加入用无血清DMEM培养基配制的含炔醇类化合物（化合物9～12）的药液，浓度分别为1.56、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L，空白组加入无血清DMEM培养基，每孔100 μL，每组设置3个复孔。培养24 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，培养1 h后用酶标仪测定450 nm波长处各孔的光密度（optical density，OD）。细胞存活率（%）＝给药组平均OD值/空白组平均OD值×100%。结果显示，4个炔醇类化合物均对RAW264.7细胞无细胞毒作用。

2.3.3 NO含量测定 用Griess法进行检测。将RAW 264.7细胞置于96孔板中，调整细胞密度为5×104个/孔，设置空白组、模型组和给药组，给药和造模同时进行（给药剂量和造模剂量依据预实验结果设置）。培养24 h后弃上清液，空白组加入无血清DMEM培养基，模型组加入含脂多糖（1 μg/mL）的无血清DMEM培养基，给药组加入用无血清DMEM培养基配制的含不同浓度的炔醇类化合物（3.13、6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L）和脂多糖（1 μg/mL），每孔100 μL，每组设置3个复孔。培养24 h后取细胞上清液在540 nm波长处测定OD值从而计算NO的含量。除化合物10以外，其他3种炔醇类化合物对NO含量均无降低作用。与模型组相比，化合物10在给药浓度为12.5、25.0、50.0 μmol/L时，可显著逆转脂多糖诱导的细胞上清液中NO含量的升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1 化合物10对RAW 264.7细胞上清液中NO含量的影响（±s，μmol/L，n＝3）

表1 化合物10对RAW 264.7细胞上清液中NO含量的影响（±s，μmol/L，n＝3）

a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01

组别（给药浓度）空白组模型组给药组（3.13 μmol/L）给药组（6.25 μmol/L）NO含量1.93±0.65 27.49±1.89a 23.53±2.75 23.58±4.07组别（给药浓度）给药组（12.5 μmol/L）给药组（25.0 μmol/L）给药组（50.0 μmol/L）NO含量19.73±2.76b 15.71±4.88b 7.21±1.71c

2.3.4 COX-2蛋白表达测定 采用Western blot法进行测定。将RAW 264.7细胞接种于6孔板中，设置空白组、模型组和给药组，给药和造模同时进行（给药剂量和造模剂量依据“2.3.3”项下结果设置）。培养24 h后，空白组加入不含药的DMEM培养基，模型组加入脂多糖（1 μg/mL），给药组加入不同浓度的化合物 10（12.5、25.0、50.0 μmol/L）和脂多糖（1 μg/mL），每组设置3个复孔。培养24 h后，于冰盒上将上清液吸出，用PBS清洗细胞，加入RIPA裂解液处理30 min，以12 000 r/min离心15 min后检测蛋白浓度。将蛋白高温变性后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转至聚偏二氟乙烯膜上，取出，用5%脱脂牛奶封闭2 h，在4℃环境下与β-actin抗体（稀释比例为1∶3 000）、COX-2抗体（稀释比例为1∶5 000）共同孵育过夜；用TBST洗涤3次后将聚偏二氟乙烯膜与辣根过氧化物酶标记二抗（稀释比例为1∶5 000）在37℃孵育2 h，再用TBST洗涤3次后用显影仪检测相应的蛋白条带。用Image J 1.8.0软件分析各条带灰度值，以COX-2蛋白与β-actin蛋白灰度值的比值作为COX-2蛋白表达量。结果见图1。与空白组比较，模型组COX-2蛋白表达量升高（P＜0.01）；与模型组比较，化合物10在给药浓度为50.0 μmol/L时能显著降低细胞中COX-2蛋白表达量（P＜0.05）。

图1 化合物10对RAW 264.7细胞炎症模型中COX-2蛋白表达的影响

3 讨论

参附注射液根据古方“参附汤”经现代工艺提取制备而成，已连续3次被遴选为全国中医医院急诊必备中成药。目前关于参附注射液的化学研究以液质分析为主，对其中的成分分离研究较少。为深入明确参附注射液的药效物质基础，本研究应用大孔吸附树脂柱色谱、中压液相色谱、制备薄层色谱、半制备液相色谱、质谱、1H-NMR、13C-NMR等手段对参附注射液的化学成分进行了分离和结构鉴定，共鉴定12个化合物，包括8个人参皂苷类化合物（化合物1～8）、4个人参炔醇类化合物（化合物9～12），其中化合物4、7、10～12均首次在参附注射液中鉴定并报道。本研究丰富了对参附注射液化学成分的认识，首次明确了人参炔醇类化合物是参附注射液中的重要组成。

人参皂苷类化合物是参附注射液的重要有效成分，目前主要以人参总皂苷的含量测定对参附注射液进行质量控制。本研究通过系统的化学成分研究发现，参附注射液中人参皂苷类成分含量高、种类较多，同时也含有丰富的聚炔类成分，但有关该类成分的研究报道较少，仅Yang等[3]应用高效液相-四极杆飞行时间串联质谱技术分析得出参附注射液中含有人参炔三醇。现代研究发现，人参炔醇类成分也具有较好的药理活性，如人参总炔醇对肺癌细胞株A549具有抑制作用[17]，人参炔醇对于小鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用、对正常大鼠心脏有负性肌力作用[18-19]等。可见，人参炔醇类成分是重要的一类活性物质。本研究采用脂多糖复制RAW 264.7细胞炎症模型，发现化合物10（人参环氧炔醇）具有明显的抗炎活性，能显著降低模型细胞中升高的NO含量和COX-2蛋白表达量。综合文献报道及本实验研究，笔者推测人参炔醇类化合物与参附注射液的药理作用具有一定的相关性。建议今后学者在开展参附注射液中药效物质基础研究和质量标准控制研究时，不应只局限于人参皂苷类成分，也应该重视对人参炔醇类成分的开发研究。