UPLC-MS联用同时测定建泽泻中8种三萜类化学成分

吴双双 孙凤灵 秦 霞 文香月 张亚敏 徐小妹 卢雪花 李丽莎 林文津 徐榕青

福建省医学科学研究院/福建省医学测试重点实验室，福建 福州 350001

泽泻始载于《神农本草经》，性寒味甘，有泄热、利水渗湿、化浊降脂的功效，主要用于高脂血症、小便不利、泄泻尿少、水肿胀满、痰饮眩晕等[1]。泽泻为常见大宗中药材，其中产于福建建瓯、建阳等地的泽泻习称“建泽泻”。三萜类成分是泽泻的主要成分，具有降血脂、降血糖、抗癌、抗菌等一系列药理活性，是泽泻发挥药效的物质基础[2-5]。泽泻中三萜类成分的常用测定方法有HPLC等[6-7]，同时检测多种三萜类成分往往用时较长，影响分析效率。UPLC-MS具有分析时间短、分析效率和分析灵敏度高的特点，尤其在同时测定中药复杂组分方面具有明显优势。本文采用UPLC-MS联用方法同时测定建泽泻中泽泻醇A等8种三萜类成分含量，旨在为建泽泻品质评价提供更准确、灵敏、简便、可靠的分析手段。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料 建泽泻植物样本(采自福建建瓯吉阳镇)，液氮冻存，洗净，60 ℃烘干后磨粉待用。采集样本经福建省建瓯市吉阳镇农技站吕竹清鉴定为泽泻科植物泽泻Alismaorientale(sam)juzep.的植株。

1.2 仪器 ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Xevo TQS三重四级杆质谱(美国Waters公司)；电子分析天平(AL204，METTLER TOLEDO(上海))；超声波清洗器(KQ3200B，昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG- 9070A，上海精宏实验设备有限公司)；高速多功能粉碎机(TYSP-100，永康市红太阳机电有限公司)；艾科浦超纯水系统(ABZ1-0501-P，颐洋企业发展有限公司)。

1.3 试剂 23-乙酰泽泻醇B(111846-201504)、甘草次酸(110723-201514)购自中国食品药品鉴定研究院；泽泻醇A(19885-10-0)、泽泻醇B(18649-93-9)、泽泻醇F(155521-45-2)、泽泻醇G(155521-46-3)、23-乙酰泽泻醇C(26575-93-9)、24-乙酰泽泻醇A(18674-16-3)、24-乙酰泽泻醇F(443683-76-9)购自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)购自德国 Merck 公司；水为超纯水；甲酸为国产分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 采用WatersCORTECSC18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流动相0.1%甲酸水-乙腈，流速0.25 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。梯度洗脱方法为(以乙腈为标准)：1～1.5 min，30%～55%；1.5～5.5 min，55%～75%；5.5～7.5 min，75%～90%；7.5～8.5 min，90%；8.5～8.6 min，90%～30%；8.5～10 min，30%。

2.2 质谱条件 采用电喷雾正离子模式；毛细管电压3.50 kV；脱溶剂气流：氮气800 L/h；脱溶剂温度500 ℃；锥孔气流：氮气150 L/h；离子源温度：150 ℃；二级锥孔萃取电压：3.00 V；碰撞气体：氩气。

2.3 溶液制备

2.3.1 混合标准品储备液制备 精密称取各标准品适量，置于25 mL容量瓶中，加入色谱纯乙腈溶液定容，配置成浓度分别为：泽泻醇A 490 mg/L、泽泻醇B 520 mg/L、泽泻醇F 500 mg/L、泽泻醇G 500 mg/L、23-乙酰泽泻醇B 490 mg/L、23-乙酰泽泻醇C 520 mg/L、24-乙酰泽泻醇A 510 mg/L、24-乙酰泽泻醇F 530 mg/L混合标准品储备液。

2.3.2 内标溶液制备 精密称取甘草次酸标准品，置于25 mL容量瓶中混匀定容成510 mg/L内标储备液。

2.3.3 样品溶液制备 称取建泽泻样品粉末约0.5 g置于50 mL锥形瓶中，精密加入乙腈25 mL并称重，超声30 min后冷却至室温，称重并用乙腈补足失重。吸取上清并用0.22 μm的微孔滤膜过滤，将滤液稀释20倍后与5.1 mg/L的甘草次酸内标溶液1∶1混合得样品溶液。

2.4 质谱测定方法 本实验采用正离子多反应监测(MRM)定量模式测定各成分含量，8个分析物及内标的具体质谱分析条件见表1，在对应参数下标准品及样品中的8个待测成分的出峰情况如图1所示。

表1 8种待测成分及内标的具体质谱分析参数

注：图中峰对应的化学成分与表1一致图1 泽泻醇A等8种成分的标准品(A)及样品(B)MRM图

2.5 标准曲线绘制 吸取混合标准品储备液和内标储备液各5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙腈定容。分别吸取上述溶液2 μL、100 μL、200 μL、1 mL、2 mL 于10 mL容量瓶中，加乙腈定容，配成5种含内标系列对照品混合溶液，泽泻醇A浓度分别为0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L，泽泻醇B浓度分别为0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,泽泻醇F浓度分别为0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,泽泻醇G浓度分别为0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,23-乙酰泽泻醇B浓度分别为 0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L,23-乙酰泽泻醇C浓度分别为0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,24-乙酰泽泻醇A浓度分别为0.0102、0.51、1.02、5.10、10.20 mg/L，24-乙酰泽泻醇F浓度分别为0.0106、0.53、1.06、5.3、10.6 mg/L。按上述色谱条件、质谱条件及测定方法对含内标系列对照品混合溶液进行测定，并记录峰面积。以待测成分峰面积与内标物质甘草次酸的峰面积比值(Y)对待测成分浓度(X)作线性回归，结果如图2所示，R2均大于0.99。

图2 泽泻醇A等8种化学成分线性关系图

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度试验 精密吸取同一份对照品混合溶液2 μL，在上述色谱质谱条件下连续进样6次，记录泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇F、泽泻醇G、23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇F与内标物的峰面积比值，RSD计算结果见表2，表明精密度良好。

2.6.2 重复性试验 精密称取同一批泽泻样品6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇F、泽泻醇G、23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇F与内标物的峰面积比值并计算含量，RSD计算结果见表2，表明重复性良好。

表2 精密度、重复性及稳定性实验结果 (n=6)

2.6.3 稳定性试验 按“2.3.3”项下方法制备1份泽泻供试品溶液，分别于0、2、6、10、12和24 h进样分析，记录泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇F、泽泻醇G、23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇F与内标物的峰面积比值并计算含量，RSD计算结果见表2，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.4 加样回收率 精密称取已知含量的泽泻样品6份，每份0.25 g，置于50 mL锥形瓶中，分别精密加入接近等量8种对照品，精密加入乙腈25 mL并称重，超声30 min后冷却至室温，称重并用乙腈补足失重，制备供试溶液。按前述方法测定含量并计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收率试验结果 (n=6)

2.7 样品含量 测定按上述液相及质谱条件对3批泽泻块茎样品进行测定，并根据回归方程计算8种待测成分的含量，每批测定3次。结果见表4。

表4 建泽泻块茎中8种三萜类成分的含量

续表4 表4 建泽泻块茎中8种三萜类成分的含量

3 讨论

三萜类成分是泽泻的主要成分，具有降脂降糖等多种活性，现行版中国药典以23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C为含量测定指标。泽泻多种三萜类成分均为泽泻发挥药效的重要物质基础，但不同产地、不同采收期、不同部位及不同炮制方法，泽泻中三萜类成分有较大差异[7-10]。广泽泻中泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A的含量显著高于建泽泻和川泽泻，川泽泻中泽泻醇B、泽泻醇C等成分的含量显著高于建泽泻[11]。以泽泻醇A24-乙酸酯峰为参照，HPLC指纹图谱显示不同产地泽泻药材的质量有差异，所含成分的种类与量不完全一致[12]。不同育苗期、移栽期和采收期对川泽泻三萜类成分均有显著影响[13]。清炒、麸炒、盐炙3种炮制方法对泽泻中泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B含量均有不同程度影响[14]。以个别的三萜成分为指标评价泽泻质量具有较大的局限性，同时采用多个三萜类成分作为指标控制泽泻药材质量十分必要。

与HPLC相比，UPLC具有更高的柱效，并且在更宽的线速度范围内保持柱稳定，有利于提高流动相速度，缩短分析时间，提高分析通量。UPLC-MS联用在同时测定中药复杂多组分方面具有独特优势，并已得到日益广泛的应用。本实验建立了同时测定泽泻中泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇F、泽泻醇G、23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇F等8种三萜成分的UPLC-MS方法，简便快捷，灵敏度高，具有良好的重现性和稳定性，结果准确可靠，为泽泻品质评价及药材质量控制提供新的分析手段。