基于虚拟筛选的丹参促成骨化合物筛选及活性验证
2022-08-25周紫艳孙苗苗唐晔翎梁鹏晨梁冬雨常庆
周紫艳, 孙苗苗, 唐晔翎, 梁鹏晨, 梁冬雨, 常庆,
(1. 上海中医药大学研究生院,上海 200120; 2. 上海大学微电子学院,上海 201800; 3. 上海健康医学院附属嘉定区中心医院临床科研中心,上海 201800)
骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微结构破坏、骨脆性增加、骨强度下降、骨折风险增大为特征的全身性代谢性骨病[1-2]。在中医药领域中,大多以“骨痹”“骨痿”“骨枯”等命名,“骨痿”的发生常由于经络不通、气血瘀阻所致[3]。丹参是唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎,具有活血化瘀、通经止痛、凉血消痈等作用[4]。研究发现,丹参对去卵巢性骨质疏松、糖皮质激素性骨质疏松、肝纤维化性骨质疏松、类风湿性关节炎致骨质疏松、维甲酸诱导的骨质疏松等均有一定的治疗作用[5],同时也有研究表明丹参的水溶性成分对骨代谢具有一定的多靶点调节作用[6]。
虚拟筛选又称计算机筛选,即在进行生物筛选之前,利用计算机进行分子对接,分子对接通常是在小分子(配体)与蛋白大分子(靶点)之间进行的,已成为了解活性化合物和分子靶点之间相互作用的一项重要工具[7]。通过分子对接能够预测靶点蛋白与活性化合物之间的结合能,从而找出治疗某些疾病的潜在药物[8]。本研究采用分子对接与活性验证相结合的方法筛选丹参中促进成骨的有效活性成分, 以期为深入挖掘丹参抗骨质疏松症的药效物质基础和开发新药提供策略。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验细胞 MC3T3-E1前成骨细胞系购于中科院上海细胞库。
1.1.2 主要仪器 超净工作台、生物安全柜(苏州净化设备公司),倒置显微镜、普通光学显微镜(德国Leica公司),电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司),CO2细胞培养箱、酶标仪(赛默飞世尔科技公司),台式高速离心机(德国Eppendorf公司),电热恒温水槽(常州金坛良友仪器有限公司),涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
1.1.3 主要试剂及材料 胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、α-MEM、PBS(美国Gibco公司),胰酶(赛默飞世尔科技公司),二甲基亚砜、茜素红(美国Sigma公司),碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京建成生物工程研究所),DAPI(上海威奥生物科技有限公司),鬼笔环肽(北京索莱宝科技有限公司),CCK-8(东仁化学科技有限公司),丹参素、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA(成都瑞思芬公司),盐酸多巴胺、氢氧化钠(罗恩试剂),医用纯钛片(上海正丰钛金属有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 丹参中活性成分的筛选 在中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP数据库,https://tcmspw.com/tcmsp.php)中,根据吸收、分布、代谢、排泄等参数,确定以OB值≥30%,DL值≥0.18为条件进行筛选。
1.2.2 分子对接 通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载活性成分的mol2格式的化学结构。通过文献搜集找到17种不同成骨相关的蛋白靶点,并从PDB蛋白数据库中下载17种蛋白靶点的pdb格式的文件。通过Autodock tools软件将活性成分的mol2格式与17种蛋白靶点的pdb格式转化成pdbqt格式,并确定每个蛋白靶点的活性口袋,再使用Autodock vina对活性成分和17种蛋白靶点分别进行对接。根据对接得分和文献的支持,最终选择丹参的4个活性成分进行后续实验。
1.2.3 试剂的制备 筛选出来的丹参活性成分是水溶性成分丹参素、丹酚酸B以及脂溶性成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮。丹参素和丹酚酸B溶解在含10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养液中,分别将其配置成浓度为0、20、40、60、80、100、120、140 μg/mL的溶液。丹参酮ⅡA和隐丹参酮使用DMSO进行溶解,随后使用含10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养液将其配置成0、1、5、10、20、40 μmol/L的溶液,待用。
1.2.4 细胞培养 将MC3T3-E1小鼠前成骨细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM,培养于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。每2 d更换1次培养液。当细胞在培养皿中生长密度达到80%~90%时,对细胞进行传代以保持细胞活力。
1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖能力 将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞使用胰酶消化,离心,并用培养液将细胞密度调至5×104个/孔,接种到96孔板中,每孔接种100 μL细胞悬浮液。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h,将培养液换成“1.2.3”方法制备的溶液,37 ℃、5% CO2继续孵育24 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,37 ℃、5% CO2孵育1 h,使用酶标仪在波长450 nm下测每孔光密度(D)值。
1.2.6 细胞ALP活性测定 将MC3T3-E1细胞以2×104个/孔的密度接种到24孔板中,每孔500 μL。37 ℃、5% CO2条件下培养24 h,将培养液换成对应制备好的溶液,继续在37 ℃、5% CO2条件下孵育,每2 d更换1次培养液。分别在1、3、5、7 d从每孔吸取30 μL溶液于96孔板中,依次加入50 μL缓冲液、50 μL基质液,37 ℃水浴下孵育15 min,加入150 μL显色剂,使用酶标仪在波长520 nm下测每孔D值。ALP活力(%)=(D测定-D空白)/(D标准-D空白)×100%。
1.2.7 DAPI-鬼笔环肽染色观察促成骨作用 MC3T3-E1细胞按1×106个/孔的密度接种于6孔板中,37 ℃、5% CO2培养24 h ,将培养液换成浓度为0、80、140 μg/mL的丹酚酸B溶液,在37 ℃、5% CO2条件下继续培养24 h。24 h后使用4%多聚甲醛溶液浸泡40 min,PBS洗涤。加入FITC-鬼笔环肽溶液染色细胞质45 min,PBS洗涤。加入DAPI溶液染色细胞核15 min,PBS洗净,在荧光显微镜下观察细胞形态。
1.2.8 茜素红染色观察促成骨作用 将MC3T3-E1细胞诱导分化后,分别以0(对照)、80和140 μg/mL丹酚酸B在6孔板中处理20 d后,除去培养基,PBS洗涤3次。4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤3次。加入适量茜素红S染色液,均匀覆盖细胞,室温染色30 min。用PBS冲洗细胞3次,显微镜下观察细胞形态。
1.3 统计学处理
2 结果
2.1 丹参中活性成分的筛选
使用TCMSP数据库筛选出43个丹参的有效活性成分。此外,虽然丹参素和丹酚酸B等成分的OB和DL值没有符合上述筛选条件,但在临床上已有大量使用,且文献调研也发现其是丹参的有效活性成分,因此将这两种成分也纳入研究目标中。表1为43种丹参的有效活性成分。
表1 丹参的有效活性成分
续表
2.2 分子对接
使用Autodock vina完成43种药物分子与17种蛋白的分子对接。首先将蛋白与它们的原配体进行对接,对接得分(结合自由能)如表2所示。再将蛋白分别与药物分子对接得到对应的对接得分,表3为相对对接得分最低的10个成分的得分情况(相对对接得分=蛋白与药物分子对接得分-蛋白与原配体对接得分),分数越低,有效活性成分和蛋白靶点之间的作用力越大。其中,与17种蛋白靶点对接效果最好的是丹参素,对接得分是-55.9 kcal/mol,因此将丹参素纳入后续的实验中。在这10个效果最好的活性成分中,丹酚酸B的对接得分为-25.9 kcal/mol,丹酚酸B也是常见的丹参中的活性成分,并且通过查阅文献发现丹酚酸B可以促进成骨,因此将丹酚酸B也纳入后续实验中。另外,根据查阅大量丹参的相关文献,发现丹参酮ⅡA和隐丹参酮都是丹参中非常常见及常用的有效成分,它们的对接得分虽然比较高,但丹参酮ⅡA是丹参中最主要的成分,而据报道隐丹参酮对骨质疏松症有一定的效果,因此我们将丹参酮ⅡA和隐丹参酮也纳入后续的实验中。
表3 43种活性成分与17种蛋白靶点的相对对接得分最低的10个成分得分情况 kcal/mol
图1为根据相对对接得分使用R语言绘制的热图,由此可以更直接地看出整体的对接得分情况。热图中方块的颜色越红,代表对应的分子与蛋白的对接自由能分数的总和越低,对接越稳定,该化合物越有可能成为治疗骨质疏松症的潜在药物。
热图中各横坐标均为17个蛋白靶点,纵坐标为各活性成分分子
图2为丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮的对接结果示意图,通过该结果可以看到丹参素与其残基GLN-37、ASP-169通过氢键作用相结合,丹酚酸B与其残基GLN-37、GLU-73、ASP-151、HIS-149、ILE-148等通过氢键作用相结合,丹参酮ⅡA及隐丹参酮均与其残基GLU-380通过氢键作用相结合。
图2 丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮的对接结果示意图
2.3 丹参活性成分对MC3T3-E1细胞的作用
丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA及隐丹参酮的不同浓度溶液对MC3T3-E1细胞的增殖效果如图3所示。丹酚酸B能促进MC3T3-E1细胞的增殖,而丹参素、丹参酮ⅡA和隐丹参酮对MC3T3-E1细胞没有增殖作用。
#:P<0.01,与0 μg/mL丹酚酸B比较
ALP活性测定结果表明,丹参素和丹酚酸B能显著增加MC3T3-E1细胞的ALP活性,而丹参酮ⅡA和隐丹参酮则没有明显效果。见图4。
#:P<0.01,与对应的0 μg/mL丹参素、丹酚酸B或0 μmol/L隐丹参酮比较
2.4 DAPI-鬼笔环肽双染色实验结果
细胞增殖情况及ALP活性测定结果显示,80 μg/mL的丹酚酸B对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞增殖的效果最好。进一步应用0、80、140 μg/mL 3组浓度丹酚酸B处理MC3T3-E1细胞,48 h后用鬼笔环肽和DAPI对处理后的细胞进行双染,荧光显微镜下细胞形态,见图5。与CCK-8及ALP活性测定实验结果相似,丹酚酸B能够促进MC3T3-E1细胞增殖,且80 μg/mL浓度条件下效果最为显著。
图5 荧光显微镜下MC3T3-E1细胞DAPI-鬼笔环肽双染情况(100×)
2.5 MC3T3-E1细胞茜素红染色结果
茜素红与钙离子以螯合方式形成复合物,产生橘红色沉积(即钙结节)。茜素红染色结果显示,培养21 d后各组均可见不同程度的钙结节形成。与0 μg/mL组相比,80 μg/mL丹酚酸B对MC3T3-E1细胞形成钙化面积明显增多、颜色加深,而140 μg/mL丹酚酸B对MC3T3-E1细胞形成钙结节的影响次之。见图6。
A:茜素红染色整体情况;B:荧光显微镜下茜素红染色情况(100×)
3 讨论
目前,大部分治疗骨质疏松症的药物都是西药,这些药物通常会产生不良反应,从而导致依从性降低[9]。现代临床试验数据显示,中医中药在治疗骨质疏松症中疗效颇为显著且安全性高[10-11]。本研究通过数据库搜索和文献调研,挑选43种候选活性成分和17个骨质疏松症相关蛋白,包括细胞外信号调节激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶1/2/3、P38蛋白激酶α/β/δ、转化生长因子激酶1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1/2、糖原合成酶激酶3β、雌激素受体α/β、黄体酮受体、酪氨酸激酶2β和组织蛋白酶K。使用Autodock vina进行分子对接,根据对接所得到的结合自由能以及蛋白与原配体之间的结合自由能之间的相对结合自由能的总和,发现与骨质疏松症的17个靶点蛋白对接效果最好的10个丹参活性成分。其中,对接得分最低的是丹参素。丹参素作为丹参中的一个水溶性化合物,由乳酸和儿茶酚组成,是一种含有两个酚羟基的化合物。有报道称丹参素可通过Wnt/Oxo3a信号通路降低氧化应激对成骨细胞分化的有害影响[12]。丹酚酸B是较为常见的丹参活性成分,由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成,在这10个活性成分中丹酚酸B的对接效果也较好。Ji等[13]发现载丹酚酸B的壳聚糖/羟基磷灰石支架可以通过血管生成和成骨促进节段性骨缺损的修复。Cui等[14]报道丹酚酸B可以通过刺激成骨和骨髓血管生成以防止强的松致大鼠骨丢失。Xu等[15]发现丹酚酸B通过激活ERK信号通路促进人间充质干细胞成骨。
除了丹参素和丹酚酸B,本研究将丹参酮ⅡA和隐丹参酮也纳入实验。丹参酮ⅡA和隐丹参酮是丹参的脂溶性活性成分。Zhu等[16]研究表明,丹参酮ⅡA通过NF-κB信号通路保护骨质疏松小鼠成骨细胞抗氧化应激。隐丹参酮具有抗炎,保护神经、心血管、内脏以及抗代谢紊乱等作用,可调节ERK和NF-κB信号通路,抑制NF-κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞发生,改善骨质疏松症[17]。
因此,本研究选取丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA和隐丹参酮作为细胞验证成分,探究其对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞系的作用。结果表明丹酚酸B在20~120 μg/mL浓度范围具有显著促进细胞增殖的作用,而其他3种化合物的增殖作用不明显;丹参素和丹酚酸B均可显著增加细胞ALP活性。故选定丹酚酸B作为对细胞成骨形态和矿化结节研究的对象,DAPI-鬼笔环肽双染实验和茜素红染色结果证实丹酚酸B在80 μg/mL浓度时对MC3T3-E1细胞的促成骨作用效果最好。
综上,本研究发现通过虚拟筛选技术筛选出的丹酚酸B在体外具有较好的促成骨细胞增殖和矿化作用。后续将在动物实验中进行验证,以进一步证明丹酚酸B具有良好的体内促成骨作用。