circ-MAT2B调节前列腺癌细胞DU145生物学行为的分子机制

杨 君，江波涛，孔东波，汪 洋

0 引 言

前列腺癌是全球男性最常见的癌症类型之一。根治性前列腺切除术、化疗或放疗是早期前列腺癌患者的重要治疗策略，但是大多数患者最终将发展为转移性疾病，5年生存率低于30%[1-2]。确定前列腺癌发生发展的机制，探索其影响因素，将为进一步提出新的前列腺癌治疗策略奠定基础。环状RNA(circRNA)是由亲本线性mRNA反向剪切形成的闭合环RNA分子，具有稳定、保守、组织/发育阶段表达特异性。目前已发现circ_0001206、circ_0007494等circRNA在前列腺癌中表达失调，参与前列腺癌进展[3]。近年研究指出circRNA蛋氨酸腺苷转移酶2B(circular RNA MAT2B, circ-MAT2B)在胃癌中明显上调，敲减circ-MAT2B可抑制胃癌细胞增殖、DNA合成、葡萄糖摄取和乳酸生成，抑制体内肿瘤生长，是潜在的胃癌诊断、预后特异性指标和治疗靶点[4]。然而，circ-MAT2B在前列腺癌中的作用并不清楚。研究发现miR-491-5p在前列腺癌中表达下调，miR-491-5p的过表达可抑制前列腺癌细胞增殖和转移能力[5]。靶基因预测显示circ-MAT2B与miR-491-5p、miR-491-5p与父系表达基因10(Paternally expressed gene 10，PEG10)存在结合位点。早期研究证实PEG10在神经内分泌前列腺癌中表达增加，下调PEG10表达可抑制肿瘤生长[6]。本研究旨在分析circ-MAT2B在前列腺癌中的表达作用，并以miR-491-5p/ PEG10轴为切入点探索其可能机制，旨在为前列腺癌治疗提供可用靶点。

1 材料与方法

1.1 组织来源收集2019年1月至2020年1月咸宁市中心医院37份前列腺癌组织和正常邻近组织样本(癌旁组织)。纳入标准：均经病理学诊断确诊；近期未接受化疗等治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并自身免疫性疾病患者；肝、肾等器官严重障碍患者。本研究经过医院伦理委员会的批准(批准号：2018KY-002-03)。所有组织样本切除后立即置于液氮中冷冻，后保存在-80 ℃冰箱直至使用。

1.2细胞和试剂前列腺癌细胞系DU145、人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1购自美国ATCC；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒购于日本TOYOBO公司；All-in-One miRNA第一链cDNA合成试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；Power SYBR Green PCR Master Mix购自美国ABI公司；小干扰RNA(si-RNA)、miRNA模拟物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(miRNA inhibitor)、荧光素酶报告载体购自上海生工生物公司；Trizol试剂、细胞计数试剂盒(CCK-8)、BCA蛋白定量试剂盒购自北京百奥莱博生物公司；Transwell小室(24孔)购自美国BD公司；膜联蛋白-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)凋亡检测试剂盒、化学发光试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(A0208)、兔源剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)单克隆抗体(AC033)、兔源B细胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗体(AB112)、兔源Bcl相关x蛋白(Bax)单克隆抗体(AF1270)、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(AF1186)购自江苏碧云天生物公司。

1.3方法

1.3.1 RT-qPCR检测前列腺组织中circ-MAT2B和miR-491-5p表达采用Trizol试剂提取37份前列腺癌组织样本和对应癌旁组织样本以及WPMY-1和DU145细胞的总RNA。采用miRNA第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。检测circ-MAT2B表达，采用ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒合成cDNA，检测miR-491-5p表达。采用SYBR Green PCR Master Mix进行RT-qPCR。以GAPDH为内对照基因，采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。circ-MAT2B上游引物5′-GATCACTGGCAGCAGAGGTT-3′，下游引物5′-CAGTGGCACCAGTAACCAGA-3′；GAPDH上游引物5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′；miR-491-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAGTGGGGAACCCTTC-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2DU145细胞的培养和分组DU145细胞接种在含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养，当细胞铺满培养皿的80%时，胰蛋白酶消化1∶3传代。将对数期DU145接种24孔板，培养至细胞铺满培养皿的40%时进行瞬时转染。转染方法：首先，用50 μL不含血清培养基稀释2 μL的脂质体Lipofectamine 2000；再用50 μL不含血清培养基稀释适量的待转染物(si-NC、si-circ-MAT2B、miR-NC、miR-491-5p mimic、si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor)；将两者混合，室温孵育20 min。将上述混合物加入到含400 μL无血清培养基的24孔板中，孵育6 h后，更换为含血清培养基培养转染48 h。根据待转染物不同将DU145细胞分为si-NC组、si-circ-MAT2B组、miR-NC组、miR-491-5p mimic组、si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组。未转染DU145细胞记为对照组。

1.3.3双荧光素酶报告实验Starbase在线预测到circ-MAT2B和miR-491-5p、miR-491-5p和PEG10-3′-UTR区域结合位点。将含有miR-491-5p预测结合位点的circ-MAT2B(或PEG10)野生型序列以及circ-MAT2B(或PEG10)的突变序列分别克隆到pGL3基本载体，分别命名为荧光素酶报告载体WT-circ-MAT2B、WT-PEG10、MUT-circ-MAT2B、MUT-PEG10。将上述载体分别与miR-491-5p mimics、miR-NC共转染DU145细胞，收集转染48 h的DU145细胞。荧光素酶活性采用双荧光素酶报告检测系统检测，以萤火虫荧光素酶活性归一化海肾荧光素酶活性表示相对荧光素酶活性。

1.3.4平板克隆实验和CCK-8检测DU145细胞增殖CCK-8实验：每组取5×103个DU145细胞接种96孔板，100 μL/孔，放入培养箱孵育48 h后，向每孔培养基中添加10 μL的CCK-8溶液。在450 nm处通过酶标仪检测各孔的吸光度值。细胞存活率(%)=实验孔A/对照孔A×100%。平板克隆实验：每组取3×102个DU145细胞接种6孔板，缓慢晃动平板使细胞分散均匀。放入培养箱培养，适时更换培养液，当看到细胞克隆时弃去细胞悬液。用甲醇固定细胞克隆，用0.5%结晶紫染色20 min。在显微镜下统计大于50个细胞的克隆数。

1.3.5划痕愈合实验和Transwell实验检测DU145细胞迁移划痕愈合实验：每组取1×104个DU145细胞接种6孔板，当细胞达到90%汇合时用无菌微量移液器吸头垂直于6孔板划伤单层细胞。洗去细胞碎片，加入无血清DMEM培养基，放入培养箱培养。在培养0 h、24 h时在显微镜下拍照，Image J软件测量划痕宽度。

划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%

Transwell实验：每组取1×105个DU145细胞接种到含200 μL无血清培养基的Transwell装置上室中。取500 μL含有10%胎牛血清培养基添加到Transwell装置下室中。培养箱孵育24 h后，用无菌棉签除去膜底表面上未迁移细胞，用甲醇固定迁移细胞5 min，然后在室温下用0.5%结晶紫染色15 min。在显微镜下随机捕获5个视野，计数染色细胞数，以平均值表示迁移细胞数。

1.3.6流式细胞术检测DU145细胞凋亡每组取1×105个DU145细胞重悬在100 μL的1×结合缓冲液中。依次加入5 μL的FITC-Annexin V、5 μL的碘化丙啶(PI)避光染色20 min。用流式细胞仪分析各组DU145细胞凋亡率。

1.3.7蛋白质印记法检测Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达RIPA法提取每组DU145细胞总蛋白，BCA法定量后，在SDS-PAGE上分离等量(20 μg)细胞蛋白，湿法转移蛋白至PVDF膜上。室温下，用5%脱脂奶粉封闭膜2 h，然后加入Cleaved-caspase3(1∶1000)、Bax(1∶2000)、Bcl-2(1∶1000)和GAPDH抗体(1∶2000)稀释液孵育2 h，最后用1∶1500稀释的酶标二抗孵育2 h。化学发光试剂盒检测蛋白条带。ImageJ 1.8软件对目的条带进行定量分析。

2 结 果

2.1 circ-MAT2B及miR-491-5p在前列腺癌组织中的表达前列腺癌组织中circ-MAT2B相对水平(4.04±0.33)较癌旁组织(1.04±0.13)显著升高(P<0.05)，miR-491-5p相对水平(0.25±0.05)较癌旁组织(1.00±0.10)显著降低(P<0.05)。前列腺癌细胞DU145中circ-MAT2B相对水平(2.96±0.24)较人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1(1.02±0.12)显著升高(P<0.05)；DU145中miR-491-5p表达水平(0.43±0.05)较 WPMY-1细胞(1.03±0.15)显著降低(P<0.05)。circ-MAT2B和miR-491-5p表达水平与前列腺癌患者的年龄无相关性(P>0.05)，与病理分期、转移、术后复发、Gleason评分显著相关(P<0.05)，见表1。

表 1 circ-MAT2B、miR-491-5p表达与临床病理指标的关系

2.2沉默circ-MAT2B后circ-MAT2B表达情况的检测及各个处理组DU145中miR-491-5p及PEG10表达的检测与对照组、si-NC组比较，si-circ-MAT2B 1组、si-circ-MAT2B 2组、si-circ-MAT2B3组DU145细胞中circ-MAT2B相对水平显著降低(P<0.05)，选择差异较大的si-circ-MAT2B 2进行实验，见表2。与对照组、si-NC组比较，si-circ-MAT2B 2组DU145细胞中miR-491-5p相对水平显著升高(P<0.05)，PEG10蛋白表达显著降低(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-491-5p mimics组DU145细胞中miR-491-5p相对水平显著升高(P<0.05)，PEG10蛋白表达显著降低(P<0.05)；与si-circ-MAT2B 2组比较，si-circ-MAT2B+ miR-491-5p inhibitor组DU145细胞中miR-491-5p相对水平显著降低(P<0.05)，PEG10蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图1，表3。

表 2 沉默circ-MAT2B处理后circ-MAT2B表达的检测

表 3 miR-491-5p及PEG10表达的比较

2.3circ-MAT2B、miR-491-5p及miR-491-5p、PEG10靶向关系验证Starbase在线分析显示circ-MAT2B和miR-491-5p存在互补结合位点，targetscan在线分析显示miR-491-5p与PEG10存在互补结合位点，见图2。与miR-NC和WT-circ-MAT2B(或WT-PEG10)共转染比较，miR-491-5p mimics和WT-circ-MAT2B(或WT-PEG10)共转染后DU145细胞的相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。见表4。

图 2 circ-MAT2B、miR-491-5p的互补序列和miR-491-5p、PEG10的互补序列

表 4 荧光素酶活性检测

2.4各组DU145细胞增殖的检测与对照组、si-NC组比较，si-circ-MAT2B 2组DU145细胞存活率、克隆形成数显著降低(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-491-5p mimic组DU145细胞存活率、克隆形成数显著降低(P<0.05)；与si-circ-MAT2B 2组比较，si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组DU145细胞存活率、克隆形成数显著升高(P<0.05)。见表5。

表 5 各组中克隆形成数及存活率的检测

2.5各组DU145细胞迁移能力的检测与对照组、si-NC组比较，si-circ-MAT2B 2组DU145细胞划痕愈合率、迁移数显著降低(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-491-5p mimic组DU145细胞划痕愈合率、迁移数显著降低(P<0.05)；与si-circ-MAT2B 2组比较，si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组DU145细胞划痕愈合率、迁移数显著升高(P<0.05)。见图3、图4，表6。

图 3 各个处理组DU145划痕愈合的检测

图4 各个处理组DU145迁移细胞数的检测

表 6 各个处理组中划痕愈合及迁移细胞数的检测

2.6各组DU145细胞凋亡的检测与对照组、si-NC组比较，si-circ-MAT2B组DU145细胞Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；与miR-NC组比较，miR-491-5p mimic组DU145细胞Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；与si-circ-MAT2B 2组比较，si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组DU145细胞Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表达、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图5、图6，表7。

图 5 各个处理组中凋亡率的检测Figure 5 Detection of apoptosis rate in each treatment group

1:对照组; 2:si-NC组; 3:si-circ-MAT2B 2组; 4:miR-NC组; 5:miR-491-5p mimic组; 6:si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组

表 7 各组凋亡率及Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达的检测

3 讨 论

研究报道circ-MAT2B在肝癌中表达增加，并通过下调miR-338-3p/M2型丙酮酸激酶(M2 type pyruvate kinase，PKM2)轴促进糖酵解，促进肝癌进展[7]。circ-MAT2B可靶向下调抑癌基因miR-610表达进而增强结直肠癌细胞的增殖能力[8]。本研究结果表明，前列腺癌组织中circ-MAT2B表达增加，并与前列腺癌患者的病理分期、转移、术后复发、Gleason评分显著相关，提示circ-MAT2B高表达可能有助于前列腺癌进展。功能验证显示，转染si-RNA干扰circ-MAT2B表达可抑制DU145细胞存活、克隆形成和迁移能力，这表明circ-MAT2B在前列腺癌中具有潜在的致癌功能。为进一步证实干扰circ-MAT2B表达的抗凋亡作用，本研究检测凋亡相关蛋白的表达水平，结果显示干扰circ-MAT2B显著抑制抗凋亡Bcl-2蛋白表达，上调促凋亡Bax蛋白表达，并激活caspase3信号，显著促进DU145细胞凋亡。这表明干扰circ-MAT2B表达对前列腺癌细胞恶性表型具有抑制作用，靶向抑制circ-MAT2B是一种潜在有效的前列腺癌干预策略。

多项研究证实circRNAs通过直接与miRNA结合，间接影响其对与靶mRNA的调控作用进而参与癌症进展[9-10]。为探索circ-MAT2B调节前列腺癌进程的潜在机制，本研究通过starbase数据库预测到miR-491-5p是circ-MAT2B的下游靶点。据报道，miR-491-5p在前列腺癌、胃癌、结肠癌等多种类型癌症中起肿瘤抑制因子作用，是癌症治疗的潜在靶标[11-12]。胃癌组织中miR-491-5p表达明显降低，过表达miR-491-5p通过下调锌指转录因子(SNAIL)可显著抑制胃癌细胞上皮-间充质转化和肿瘤转移[13]。骨肉瘤中miR-491-5p靶向PKM2对细胞增殖促进作用[14]。此外，miR-491-5p作为circ0001361的靶基因介导其对乳腺癌细胞的促转移作用[15]。本研究结果表明前列腺癌组织中miR-491-5p表达降低，这与前人报道吻合[53]。此外，miR-491-5p表达水平还与前列腺癌患者的病理分期、转移、术后复发、Gleason评分显著相关。功能分析显示，转染miR-491-5p mimics过表达miR-491-5p可抑制DU145细胞存活、克隆形成和迁移能力，下调Bcl-2表达、上调Bax表达、激活caspase3信号，并诱导DU145细胞凋亡。由于miR-491-5p表达受到circ-MAT2B的靶向负性调控，且miR-491-5p过表达与干扰circ-MAT2B表达的抗前列腺癌作用一致，提示前列腺癌中存在circ-MAT2B/miR-491-5p调控途径。

PEG10位于人类染色体7q21.3上，其高表达与实体瘤发生率高，分化程度低，淋巴结转移增加和TNM分期晚期有关[16]。PEG10通过调控细胞周期进展和侵袭促进神经内分泌前列腺癌的进展[17]。本研究证实PEG10是miR-491-5p的靶基因，过表达miR-491-5p、干扰circ-MAT2B对PEG10表达均有抑制作用。回复实验显示，抑制miR-491-5p表达能逆转干扰circ-MAT2B表达对DU145细胞存活、克隆形成、凋亡、迁移以及PEG10表达的影响，这表明circ-MAT2B可能通过调控miR-491-5p/PEG1轴进而在前列腺癌中发挥功能。然而，同一个circRNA含有多个miRNA结合位点，同一个miRNA也可调控多个靶mRNA表达，circ-MAT2B是否通过miR-491-5p/PEG1轴之外其他miRNA/mRNA轴调控前列腺癌进展仍需进一步探索。

总之，前列腺癌中circ-MAT2B表达上调，干扰circ-MAT2B可能通过上调miR-491-5p/ PEG10轴来诱导前列腺癌细胞DU145凋亡，抑制其增殖和迁移，这进一步揭示了前列腺癌中circRNA/miRNA/mRNA调控网络，提示circ-MAT2B/miR-491-5p/ PEG10轴可能是前列腺癌的治疗靶点。