线粒体内膜转位酶50 在人胃癌组织中的表达及其临床意义△

张王吉，左云，施晓婧，吴倍佩，倪晨，张永芹

苏州大学附属张家港医院肿瘤科，江苏 张家港 215600

胃癌是目前世界范围内第五大常见恶性肿瘤，也是肿瘤相关死亡的第四大原因，2020 年新增胃癌患者100 多万例，估计有79.6 万例死亡（相当于全球每13 例死亡病例中就有1 例因胃癌所致）[1]。中国是胃癌的高发国家，2020 年中国胃癌新发病例和死亡病例分别占全球的62.3%和51.4%[1]。由于胃癌早期症状不典型及患者对症状的忽视，致使中国约80%的初治胃癌患者已处于进展期和晚期[2-3]。胃癌晚期治疗以化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等综合治疗为主，但治疗效果不尽如人意，5 年生存率仅为35.9%[4]。因此，了解胃癌的发生发展机制，寻找新的诊断和治疗靶点成为胃癌治疗的重中之重。线粒体内膜转位酶50（translocase of inner mitochondrial membrane 50，TIM50）是位于线粒体内膜的TIM23 复合体的一个亚基，在线粒体蛋白输入和分选中发挥重要作用[5]。人TIM50 由353 个氨基酸组成，大小约为40 kD[6]。在基础条件下，TIM50 作为线粒体蛋白前序列受体，与TIM23亚基相互作用促进前序列蛋白从线粒体外膜转位酶向TIM23 移交，也触发了TIM23 前蛋白转导通道基质侧的输入马达的组装和激活，在线粒体蛋白输入过程中起早期作用[7]。近年来，TIM50 促进多种肿瘤发生发展的作用日益受到关注。研究表明，TIM50作为潜在致癌因子在乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、肾母细胞癌等恶性肿瘤中呈高表达[8-12]。但TIM50 在人胃癌中的表达国内外文献尚无报道。因此，本研究对人胃癌组织中TIM50 的表达及其临床意义进行探讨，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016 年6 月至2018 年7 月苏州大学附属张家港医院收治的85 例胃癌患者作为研究对象。纳入标准：①接受胃癌切除术且经病理检查确诊为胃癌；②术前未接受过放化疗。排除标准：①合并其他肿瘤；②病历资料不完整。85 例胃癌患者中，男性56 例，女性29 例；年龄：≥60 岁55 例，﹤60岁30 例；肿瘤直径：≥5 cm 58 例，﹤5 cm 27 例；病理分级：Ⅰ/Ⅱ级25 例，Ⅲ/Ⅳ级60 例；TNM 分期：Ⅰ/Ⅱ期33 例，Ⅲ/Ⅳ期52 例；有淋巴结转移60 例，无淋巴结转移25 例；有远处转移1 例，无远处转移84 例。取85 例胃癌患者的胃癌组织及癌旁组织。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 随访

以复诊或电话方式对胃癌患者术后生存情况进行随访，特殊患者必要时上门回访。总生存时间为术后至随访截止时间或死亡时间的间隔。随访时间36 个月，随访截止时间为2021 年7 月。

1.3 主要试剂

兔抗TIM50 多克隆抗体（22229-1-AP）购自美国PROTEINTECH 公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔二抗及CY3 标记的山羊抗兔荧光二抗均购自Life 公司。

1.4 免疫组化检测

取新鲜胃癌组织及癌旁组织标本，4%甲醛固定，脱水处理后用石蜡包埋，4 μm 厚度连续切片。切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，室温下3%H2O2孵育10 min。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤3 min×3 次，抗原修复后加山羊血清室温封闭1 h；加兔抗TIM50 多克隆一抗（1∶1000），4 ℃过夜；PBS 洗涤3 min×3 次，加入HRP 标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30 min；PBS洗涤5 min×3 次，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色5 min；苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡，中性树脂封片。待其干燥后，用光学显微镜（×200）观察染色情况。

1.5 免疫组化评估

阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0分，1%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，76%～100%为4 分。染色强度评分：无染色为0 分，弱染色为1 分（+），中等强度染色为2 分（++），强染色为3 分（+++）。总评分=阳性细胞百分比评分×染色强度评分。根据总评分将患者分为两组，总评分0～4 分为TIM50 低表达组，总评分5～12 分为TIM50 高表达组。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析。计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，生存情况的比较采用Log-rank 检验。以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIM50 表达情况的比较

免疫组化结果显示，胃癌组织中TIM50 主要定位于细胞质中（图1）。85 例胃癌组织中58 例（68.2%）患者TIM50 高表达，27 例（31.8%）患者TIM50 低表达；85 例癌旁组织中11 例（12.9%）患者TIM50 高表达，74 例（87.1%）患者TIM50 低表达；胃癌组织中TIM50 高表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（χ2=53.886，P﹤0.01）。

图1 胃癌组织及癌旁组织中TIM50的表达情况（免疫组化染色，×200）

2.2 不同临床特征胃癌患者的胃癌组织中TIM50表达情况的比较

不同病理分级胃癌患者的胃癌组织中TIM50表达情况比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；不同年龄、性别、肿瘤直径、TNM 分期、T 分期、N 分期、M 分期胃癌患者的胃癌组织中TIM50 表达情况比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同临床特征胃癌患者的胃癌组织中TIM50 表达情况的比较

2.3 生存情况的比较

采用Kaplan-Meier 法绘制胃癌患者生存曲线，结果表明，TIM50 高表达与TIM50 低表达胃癌患者的3 年生存率比较，差异无统计学意义（χ2=1.862，P=0.172）。（图2）

图2 TIM50高表达（n=58）与低表达（n=27）胃癌患者的生存曲线

3 讨论

胃癌是中国常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均居第二位，严重危害居民的生命健康[13]。目前国内外研究明确胃癌的病因包括幽门螺杆菌感染、不良饮食习惯、非甾体抗炎药等，但胃癌发生发展分子生物学机制尚未明确[14]。

越来越多证据表明，TIM50 除参与线粒体蛋白输入外，还参与其他功能。研究发现，人TIM50 在肾上腺和睾丸类固醇合成中发挥重要作用[15]。此外，TIM50 也参与了白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）诱导的白细胞介素-1 受体相关激酶2（interleukin-1 receptor-associated kinase 2，IRAK2）线粒体易位抑制脂肪细胞氧化代谢途径[16]。有趣的是，TIM50 可以通过降低氧化应激来减轻病理性心肌肥厚[17]，有望成为防治心肌肥厚和心力衰竭的新靶点。多篇报道表明，TIM50 基因突变与先天代谢缺陷疾病3-甲基戊烯二酸尿症相关，此外研究者对患者线粒体功能综合分析后发现，TIM50 突变通过靶向线粒体的几个关键方面，包括维持线粒体形态、Oxphos 组装和线粒体呼吸能力，导致线粒体功能的普遍缺陷[18-21]。

近年来研究发现，TIM50 水平与各种肿瘤细胞的生长和增殖直接相关[10]。据报道，TIM50 的表达可能通过p53 突变体的过度表达而上调，从而导致乳腺癌和非小细胞肺癌的生长和化学耐药[9]。研究表明，TIM50 可能抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡[11]。在非小细胞肺癌中，TIM50 水平与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移和总生存率直接相关。同一项研究还发现，TIM50 通过细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路促进肿瘤进展并预测非小细胞肺癌患者的不良预后[10]。据报道，肉瘤中发挥抗肿瘤作用的miRNA-7 可调节TIM50 的表达[22]。食管癌中，LOC100133669 表达上调与预后不良相关，在研究潜在致癌机制时发现，其与TIM50 相互结合通过抑制泛素化上调其蛋白水平。此外，LOC100133669 基因被敲低时，过表达TIM50 可挽救食管癌细胞的生长[12]。研究发现，TIM50可能是肾母细胞瘤中原癌基因MYCN的靶基因，表达水平随着MYCN的耗竭而下调[8]。为了分析TIM50在胃癌中扮演的角色，本研究检测并分析了TIM50 在胃癌及癌旁组织中的表达情况及与患者临床特征的关系。

本研究结果显示，85 例患者胃癌组织中TIM50 高表达率明显高于癌旁组织，说明TIM50 与胃癌的发生发展关系密切。研究还进一步发现，胃癌组织中TIM50 蛋白表达与病理分级有关，病理分级Ⅲ～Ⅳ级胃癌患者的胃癌组织中TIM50 阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ级患者（P﹤0.05）；TIM50 表达与年龄、性别、肿瘤直径、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期无关。该结论提示TIM50 表达与胃癌恶性程度有关。本研究还表明，TIM50 高表达患者的3 年生存率较TIM50 低表达患者低，但差异无统计学意义，考虑与随访时间太短有关，将继续随访，探求5 年生存率差异是否有统计学意义。

综上所述，TIM50 在胃癌组织中呈高表达，与胃癌的发生发展有关，TIM50 有可能成为新的临床胃癌早期诊治靶点，并对评价胃癌恶性程度、早期诊断具有重要意义。