4-乙烯基苯硼酸聚合物纳米材料的制备及其在果糖检测中的应用

李 涛张 睿聂玘豪吴浩君王欣惠吴海彤孙晓丽

(福建师范大学 环境科学与工程学院，福建 福州 350007)

0 引言

果糖是食品工业中一种重要的糖，常用作食品甜味剂。但是果糖摄入过多会导致肥胖、非酒精性脂肪肝和代谢不良等疾病，所以对果糖的检测十分必要[1-4]。目前，针对果糖检测的方法主要有离子色谱法[5]，气相色谱法[6]、紫外检测法[7]、高效液相色谱检测法[8]和荧光检测法[9]，其中荧光检测法具有操作简便，易于观察等优点。硼酸基团可以和果糖等1，2-二醇类化合物可逆地结合，形成五元环[10-13]。这些环酯的形成往往伴随着一定的荧光变化[14，15]。所以利用硼酸基团合成传感器来检测果糖一直是许多研究小组的重点[16-18]。Pooryousef课题组合成了9，9-二甲基-9H-芴-2，7-二基-2，7-二硼酸小分子，利用其硼酸基团结合果糖导致荧光淬灭来检测果糖，在果糖浓度为5×10－5至10－1mol/L的浓度范围内，对果糖显示出线性响应，检测限为2×10－5mol/L[19]。相比于硼酸小分子，高分子纳米材料具有生物相容性好，结构形貌易调控等优点，在传感器应用中将含硼聚合物自组装成纳米材料成为新的趋势[20]。Vlies课题组采用水分散聚合法合成了粒径为80～250 nm 的具有框状形貌的苯基硼酸纳米粒子，纳米粒子通过茜素红S置换法利用荧光淬灭现象来检测果糖，检测限达到1.5 mmol/L[21]。

核壳结构为精确控制颗粒中功能基团的空间分布提供了可能，因此本文通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)方法合成了聚(4-乙烯基苯硼酸)-b-聚(N，N 二甲基丙烯酰胺)嵌段共聚物(PVPBA-b-PDMA)，同时利用溶液自组装方法制备了2种尺寸的核壳结构球状纳米材料，PDMA 作为壳提供纳米材料良好的生物相容性和稳定性，苯硼酸功能基团分布于纳米材料核中。纳米材料核中的硼酸基团与染料茜素红S(ARS)、槲皮素(QC)、8-羟基喹啉(HQ)结合后，其体系产生荧光，构建了新型荧光传感器，利用这类荧光传感器，可以实现对果糖的特异性检测，具体表现为体系发生荧光淬灭现象。通过将纳米材料与二元醇染料结合制备的荧光传感器在果糖检测中显示出高灵敏度和特异性的优点。

1 实验步骤

1.1 仪器与试剂

偶氮二异丁腈(AIBN，阿拉丁试剂，98%)在甲醇中重结晶两次。S-1-十二烷基-S-(α，α'-二甲基-α''-乙酸)三硫代碳酸酯(TTC)作为链转移剂根据文献方法合成[22]。四氢呋喃(THF)在使用前用Na/二苯甲酮蒸馏干燥。N，N 二甲基丙烯酰胺(DMA)、4-溴苯乙烯、镁、茜素红S(ARS)、槲皮素(QC)、8-羟基喹啉(HQ)、果糖、葡萄糖、硼酸三甲酯、盐酸等不需经过处理可直接使用。

1.2 4-乙烯基苯硼酸(VPBA)的合成

取2.5 g(102.8 mmol)新鲜镁屑加入到含有磁子的250 m L 反应管中，直口用橡胶塞密封，支口与真空泵相连，将体系中的空气抽出，并用热风枪200 ℃吹烫3 min，待温度降至室温后通入氮气，此过程重复三次。向反应管中加入30 m L四氢呋喃溶液，取15.69 g(85.7 mmol)4-溴苯乙烯溶于20 m L 四氢呋喃溶液中。在氮气保护下向反应管中缓慢加入配置好的4-溴苯乙烯四氢呋喃溶液，搅拌反应3 h，制备得到4-乙烯基溴化镁格氏试剂。

取250 m L反应管加入磁子，直口用橡胶塞密封，支口与真空泵相连，将体系中的空气抽出，并用热风枪200 ℃吹烫3 min，待温度降至室温后通入氮气，此过程重复三次。取8.908 g(85.7 mmol)硼酸三甲酯溶于40 m L四氢呋喃溶液中，加入到反应管中，在氮气保护和冰水浴的条件下，将制备的格氏试剂缓慢加入到反应管中，滴加过程持续30 min，搅拌反应过夜得到乳白色溶液。后加入60 m L 2 mol/L的盐酸，搅拌2 h，用乙酸乙酯、蒸馏水萃取三次得到黄色溶液，加入无水硫酸镁干燥至澄清透明，抽滤浓缩有机相，采用石油醚:乙酸乙酯＝10∶1的洗脱液进行柱层析，得到5.55 g 4-乙烯基苯硼酸单体，产率43.7%。核磁氢谱(400核 磁 碳 谱(400 MHz，DMSO-d6，δ):δ ＝139.00核磁硼谱(600 MHz，DMSO-d6，δ):δ＝27.58(1B，-(OH)2)。反应过程如图1所示。

图1 4-乙烯基苯硼酸(VPBA)合成路线流程图

1.3 聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)的制备

按照摩尔比100∶1∶0.5称取9.9 g(100 mmol)DMA 单体，364 mg(1 mmol)链转移剂十二烷基三硫代碳酸酯，16.4 mg(0.1 mmol)引发剂AIBN 溶于10 m L四氢呋喃溶液，加入到带磁子的聚合管中。重复冷冻-抽真空-解冻操作3次至完全除去体系中的氧气后，80 ℃下磁力搅拌反应24 h，迅速降温终止反应，将反应液滴加入过量石油醚中，聚合物沉淀析出，重复2次。过滤后将固体室温下真空干燥，得到浅黄白色固体8.715 g，产率为82.5%。核磁氢谱

1.4 PVPBA-b-PDMA嵌段共聚物的制备

按照摩尔比500∶1∶0.5称取0.5 g(3.37 mmol)VPBA 单体，60.2 mg(0.006 7 mmol)链转移剂PDMA，0.54 mg(0.003 3 mmol)引发剂AIBN 溶于2 m L 四氢呋喃溶液，加入到带磁子的聚合管中。重复冷冻-抽真空-解冻操作至完全除去体系中的氧气后，80 ℃下磁力搅拌反应24 h，迅速降温终止反应，将反应液滴加入过量石油醚中，聚合物沉淀析出，重复2 次。室温下真空干燥，得到浅黄白色固体0.24 g，产率为48%。核磁 氢 谱红外光谱(KBr压片，cm－1):3 406(brs)，2 924(m)，2 852(w)，1 609(m)，1 561(w)，1 511(w)，1 411(s)，1 342(s)，1 116(m)，1 015(m)，831(m)，749(m)，651(m)，634(w)。

按照摩尔比1000∶1∶0.5称取0.5 g(3.37 mmol)VPBA 单体，30.1 mg(0.003 3 mmol)链转移剂PDMA，0.27 mg(0.001 7 mmol)引发剂AIBN 溶于2 m L 四氢呋喃溶液，按照相同操作，得到浅黄白色固体0.31 g，产率为73%。核磁氢谱红外光谱(KBr压片，cm－1):3 405(brs)，2 924(m)，2 851(w)，1 608(m)，1 561(w)，1 511(w)，1 411(s)，1 342(s)，1 115(m)，1 015(m)，831(m)，749(m)，651(m)，634(w)。反应过程如图2所示。

图2 PVPBA-b-PDMA 嵌段聚合物合成路线流程图

1.5 PVPBA-b-PDMA纳米材料的制备

利用溶液自组装的方法，将10 mg PVPBA-b-PDMA 嵌段共聚物溶于1 m L四氢呋喃溶液中，利用推动泵以1 m L/h的流速匀速地将四氢呋喃溶液滴加到10 m L去离子水中，透析3 h，每隔1 h更换去离子水，去除体系中的四氢呋喃得到纳米材料水溶液，其浓度为1 mg/m L。

1.6 结构表征

采用核磁共振(NMR Bruker 400 MHz)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR BNICOLET IS10)分析样品的化学结构，采用场发射扫描电子显微镜(FESEM HITACHI Regulus 8100)记录纳米材料的形貌，采用荧光光谱(RF-5301pc)记录纳米材料与染料、果糖结合产生的荧光变化。

1.7 荧光传感器的构建与荧光测试

PVPBA-b-PDMA 纳米材料与HQ、ARS、QC 结合构建荧光传感器:取1 m L 配置好的纳米材料水溶液，加入不同含量的染料如HQ、ARS和QC，静置5 min后，记录溶液荧光强度与染料浓度的关系。激发狭缝宽度为5 nm，发射狭缝宽度为10 nm。

PVPBA-b-PDMA/QC与果糖的荧光测试:取1 m L配置好的纳米材料水溶液，加入9.07 mg QC，配置成含有30 mmol/L QC，5.8 mmol/L苯基硼酸基团的荧光传感器，加入不同含量的果糖，静置5 min后，记录溶液荧光强度与染料浓度的关系。激发狭缝宽度为5 nm，发射狭缝宽度为10 nm。

所有荧光测量均在室温下进行。通过将数据拟合到方程(1)中来计算Stern-Volmer静态猝灭常数

式中F是初始未淬灭的荧光强度，F0是存在猝灭剂时的荧光强度，Ksv是静态猝灭常数，Q是猝灭剂浓度。

通过将数据拟合到等式(2)中计算检测限

式中σ表示空白溶液的荧光强度标准偏差，Ksv表示荧光静态猝灭拟合曲线的斜率。

2 结果与讨论

2.1 结构与形貌

2.1.1 结构分析。VPBA 的核磁共振氢谱、碳谱、硼谱谱图如图3所示，从核磁氢谱可以看出，VPBA 单体含有6种不同化学环境的氢原子，图3(a)中a处(δ＝5.29，5.89)的信号峰为乙烯基双键=CH2上的H，b处(δ＝6.76)的信号峰为与双键相连的=CH-中的H，c处(δ＝7.44)的信号峰为苯环上靠近双键的氢，d处(δ＝7.77)的信号峰为苯环上靠近硼羟基的氢，e处(δ＝8.08)为硼羟基-B(OH)2的氢信号峰。同时核磁碳谱在139.00，137.25，134.90，125.61，115.21出现了信号峰，核磁硼谱在27.58出现了唯一的硼酸基团信号峰。核磁谱图证明了VPBA 的成功合成。

图3 VPBA 的核磁共振氢谱(a)、碳谱(b)和硼谱(c)

图4为PDMA 的1H 核磁谱图，从核磁氢谱可以看出，双键特征信号峰的消失，1～2出现的宽主链信号峰，以及对核磁信号峰的归属，证实了PDMA 的合成，通过比较2.79与5.07的峰面积积分，计算出均聚物PDMA 的聚合度为90。

图4 PDMA 的核磁共振氢谱

图5为PVPBA-b-PDMA 嵌段聚合物的核磁共振氢谱图与FT-IR 光谱图，通过比较6.60与2.75的鼓包峰面积积分，计算出了嵌段聚合物的结构为PVPBA315-b-PDMA90，PVPBA730-b-PDMA90。通过嵌段聚合物的FT-IR 光谱(如图5(c)、(d)所示)，3 405 cm－1(-OH 键)，1 608 cm－1(C=O 键)，1 342 cm－1(B-O 键)，以及1 015 cm－1(B-O-H 伸展)的出现进一步验证了PVPBA 链段的存在，以及PVPBA-b-PDMA 嵌段聚合物的形成。

图5 (a)PVPBA315-b-PDMA90; (b)PVPBA 730-b-PDMA 90的核磁共振氢谱;(c)PVPBA 315-b-PDMA 90; (d)PVPBA730-b-PDMA90的FT-IR 光谱图

2.1.2形貌。图6是纳米材料的扫描电镜图，从6(a)可以看出，由PVPBA315-b-PDMA90自组装形成的纳米材料呈现出了核壳球形结构，粒径约为100 nm，大部分尺寸较均匀，但是也存在极少300 nm 的球壳结构纳米材料。而从6(b)可以看出当摩尔比VPBA∶PDMA＝1 000∶1时，PVPBA730-b-PDMA90自组装形成的纳米材料也呈现出了核壳球形结构，粒径约为200 nm，但会形成小尺寸的团聚体。通过改变VPBA 与PDMA的摩尔比，我们可以得到2种尺寸的核壳结构纳米材料。

图6 (a)PVPBA315-b-PDMA90; (b)PVPBA730-b-PDMA90纳米材料形貌

2.2 荧光传感器的构建与荧光测试

图7为纳米材料与HQ、QC、ARS结合之后的荧光光谱。在400 nm 激发波长的激发下，PVPBA315-b-PDMA90和PVPBA730-b-PDMA90纳米球在与ARS结合后，在580 nm 左右出现了发射峰，表现出了红色荧光。在400 nm 激发波长的激发下，PVPBA315-b-PDMA90纳米球与HQ 结合之后在500 nm 出现了发射峰，表现出了绿色荧光，而PVPBA730-b-PDMA90纳米球与HQ 结合之后在485 nm 出现了发射峰，表现出了绿色荧光，其荧光强度弱于PVPBA315-b-PDMA90与HQ 结合产生的荧光强度。纳米材料与QC 结合之后，在440 nm 激发波长的激发下，在575 nm 左右出现发射峰，表现出暗红色荧光，相比于与HQ、ARS结合，与QC 结合之后其荧光强度明显增强。同时比较2种尺寸的纳米结构与QC结合产生的荧光强度，PVPBA315-b-PDMA90/QC的荧光强度(635)比PVPBA730-b-PDMA90的荧光强度(440)略强，这是因为当PVPBA 链段越长时，其自组装形成纳米球的核尺寸越大，在一定程度上会妨碍内部的硼酸基团与QC结合。我们利用硼酸基团与二醇染料的结合，成功构建了三种荧光传感器。

图7 PVPBA315-b-PDMA90纳米材料与不同浓度的ARS(a)，HQ(b)，QC(c)结合的荧光光谱;PVPBA 315-b-PDMA 90纳米材料与不同浓度的ARS(d)，HQ(e)，QC(f)结合的荧光光谱

将果糖和葡萄糖(浓度为200 mmol/L)分别加入到三种荧光传感器中，如图8所示。我们发现当将果糖加入到PVPBA-b-PDMA/QC荧光传感器中时，体系荧光发生了明显的淬灭现象，达到了检测果糖的目的。当加入葡萄糖之后，PVPBA-b-PDMA/QC体系荧光没有发生明显变化，因此PVPBA315-b-PDMA90/QC可以实现对果糖的特异性检测。我们利用VPBA315-b-PDMA90/QC荧光传感器荧光强度高的优点，进行后续灵敏度实验。

图8 荧光传感器加入果糖或葡萄糖的荧光照片示意图(365 nm 紫外灯照射下)

图9为荧光传感器PVPBA315-b-PDMA90/QC 检测果糖的荧光光谱，从图中可以看出，当果糖的加入量为5.5 mmol/L时，荧光强度开始减小，在165 mmol/L 的时候荧光趋于消失，即果糖的加入会导致荧光淬灭，我们认为造成这种现象的原因是果糖与硼酸基团的结合力大于染料QC，当果糖竞争性地与硼酸基团结合，染料与硼酸基团结合断开之后，其荧光消失，发生荧光淬灭现象。当果糖浓度在0～82.5 mmol/L范围内时，其荧光淬灭的Stern-Volmer曲线表现出线性关系，其检测限为60 nmol/L，与其他材料检测果糖效果相当[24]。

图9 (a)PVPBA315-b-PDMA90/QC检测不同浓度果糖的荧光光谱(在440 nm 激发);(b) 荧光淬灭的Stern-Volmer

3 结论

本文采用RAFT 聚合和溶液自组装方法制备了PVPBA-b-PDMA 球状纳米材料，通过NMR、FT-IR 证实了聚合物的合成，SEM 证实了纳米材料是具有100、200 nm 两种尺寸的核壳结构。纳米材料与HQ、QC、ARS结合后其溶液产生荧光现象，利用这样的特性，成功构建了PVPBA315-b-PDMA90/QC 荧光传感器，在果糖浓度为0～82.5 mmol/L 范围内，可以实现线性的荧光淬灭，其检测限可以低至60 nmol/L，成功实现了对果糖的高灵敏度和特异性检测。