基于二氰基异佛尔酮近红外荧光探针的合成及其可视化检测铜离子特性研究

王 洋邓振鹏邓兰兰霍淑慧周鹏鑫黄现强

(1.西北师范大学 化学化工学院，甘肃 兰州 730070；2.聊城大学 化学化工学院，山东 聊城 252059)

0 引言

铜作为人体不可或缺的一种微量元素，人们通常由日常饮食摄入[1]。铜离子对于人体的正常代谢、发育等有着非常重要的影响[2]，但是当铜离子含量超过人体细胞的需要时，过量的铜离子也会引起蛋白质的沉淀，破坏细胞的原生质[3]，并且细胞中过量的铜离子也会破坏人体的神经系统，导致人体患上阿尔茨海默病、帕金森病等[4]。而Cu2＋易通过食物链富集，最终严重危害人体健康。因此，对于环境中和人体内Cu2＋的检测很有必要。传统的检测方法包括电感耦合等离子体法(ICP-MS)，原子吸收光谱法(AAS)、电化学法等[5]。这些方法需要依赖大型仪器，使得Cu2＋的检测成本高昂；且操作复杂，无法迅速地检测Cu2＋。荧光探针具有易操作、成本低廉、专一识别、肉眼可见等优点，近年来被广泛应用于Cu2＋的检测[6]。科学家们在设计荧光探针时，由于具有近红外发射的荧光探针分子具有细胞毒性低、良好的生态环境和生物兼容性、强的组织穿透力、小的细胞组织损伤性等优点，都希望探针分子拥有近红外的发射[7，8](＞600 nm)；且为了避免吸收光谱和发射光谱之间光谱重叠较大，科学家们尽可能地追求大的Stokes位移，从而使得探针分子在荧光发射中尽可能地提高荧光辐射在能量耗散中的比例。其中，二氰基异佛尔酮是一种良好的荧光母体，具有Stokes位移大、近红外发光、易合成等特点，近年来被广泛应用于各种离子(分子)的检测[9]。目前的Cu2＋探针虽然取得了较大的进展，但是存在选择性差，其他金属离子对Cu2＋的检测具有一定的干扰性；Stokes位移小，导致探针分子的吸收光谱和发射光谱之间有重叠，致使探针分子的荧光辐射比例降低；发射波长短，使得探针分子的细胞毒性高、生物兼容性差，难以应用于生物体体内内源性和外源性Cu2＋的检测[10]。因此，合成了一种基于二氰基异佛尔酮母体用于专一识别Cu2＋的探针W1，探针W1拥有近红外的荧光发射、大的Stokes位移；多个N、O 原子，可以很好的与Cu2＋配位，从而传递荧光信号且不受其他金属离子干扰。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

所用试剂均为分析纯，购买自上海泰坦科技股份有限公司，金属离子溶液均来自于相应的硝酸盐，以二级去离子水定容。核磁测定:Varian Mercry 400plus超导核磁共振波谱仪，400/600 MHz for1H NMR，150 MHz for13C NMR)，以四甲基硅烷(TMS)做内标.在氘代溶剂中测定。质谱:HP5989B质谱仪。紫外可见吸收光谱(UV):Shimadzu Model 3 100 UV-vis紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。荧光发射光谱:F97 pro荧光分光光度计荧光光谱仪(南京诺泰施格科学仪器有限公司)。激发波长为416 nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度为10 nm。扫描速度:1 000 nm/min。

1.2 化合物1的合成

化合物1的合成按照已经报道的方法合成[11]:在100 m L的两口瓶中，将异佛尔酮(1.38 g，10 mmol)和丙二腈(0.66 g，10 mmol)溶解于8 m L DMF中，再分别加入300μL哌啶和250μL乙酸酐以及150μL冰醋酸，混合体系在室温下搅拌6 h，然后将混合物在氮气保护下回流(120 ℃)4 h，反应结束后，将混合物倒入1 000 m L冰水中，有大量黑色沉淀析出，过滤收集沉淀，置于真空烘箱中干燥过夜；接着，用异丙醇/水重结晶得到黄色固体1.39 g，产率:75%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:6.60(d，J＝1.2 Hz，1H)，2.50(s，2H)，2.16(s，2H)，2.02(s，2H)，1.00(s，6H).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:170.05，159.46，120.25，112.86，77.92，45.6，42.32，32.05，27.50，24.99。

1.3 化合物2的合成

化合物2的合成参照文献报道的方法[12]，具体如下:在100 m L 的两口瓶中，将化合物2-1(372 mg，2 mmol)和对羟基苯甲醛(244 mg，2 mmol)溶于10 m L乙醇中，分别加入100μL 哌啶和冰醋酸作为催化剂，混合体系在氮气保护下回流(80 ℃)6 h，冷至室温后，减压下除去溶剂，用二氯甲烷/水萃取，收集有机并用无水硫酸钠干燥过夜，粗产品用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂:二氯甲烷)，得到红色固体化合物435 mg，产率:75%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.87(s，1H)，9.87(s，1H)，7.81(d，J＝8.7 Hz，2H)，7.42(d，J＝8.7 Hz，2H)，6.96(d，J＝8.6 Hz，2H)，6.86(d，J＝8.6 Hz，2H)，2.59(s，4H)，1.07(s，6H).13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ:170.32，159.41，156.76，138.35，129.94，127.19，126.32，121.44，115.95，114.20，113.38，74.89，42.40，38.28，31.74，27.52。

1.4 化合物3的合成

化合物3的合成参照文献报道的方法[13]:将化合物2(360 mg，1.24 mmol)溶解于5 m L 三氟乙酸中，再加入乌洛托品(348 mg，1.2 mmol)，混合物加热回流，用TLC法检测至原料点消失(约2 h)，反应完成后，倒入大量冰水中，有固体析出，收集并干燥固体，用硅胶色谱柱纯化(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝20/1，v/v)，得到黄色固体化合物241 mg，产率:61%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.18(s，1 H)，9.94(s，1H)，7.72(s，1H)，7.05(d，J＝8.5 Hz，1H)，7.00(s，1 H)，6.92(d，J＝16.2 Hz，1 H)，6.85(s，1 H)，2.61(s，2 H)，2.46(s，2 H)，1.09(s，6H).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:196.23，169.04，162.54，153.33，135.31，134.73，132.93，128.36，128.02，123.53，120.69，118.70，112.63，42.93，39.20，32.01，27.99。

1.5 化合物4的合成

在50 m L单口瓶中，将水杨醛(244 mg，2 mmol)溶于10 m L 乙醇中，搅拌下加入水合肼(500 mg，10 mmol)，然后加入100μL冰醋酸，混合物搅拌回流(80 ℃)过夜，反应完成后，减压除去溶剂，粗品用二氯甲烷重结晶得到198 mg白色细针状晶体，产率:70%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.41(s，1H)，8.72(s，1 H)，7.39(dd，J＝18.2，7.9 Hz，2 H)，7.04(d，J＝8.2 Hz，1 H)，6.98(d，J＝7.5 Hz，1H)，1.26(s，2H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:164.69，159.80，133.43，132.99，119.72，117.21。

1.6 探针W1的合成

在50 m L单口瓶中，将化合物3(32 mg，0.01 mmol)和化合物4(14 mg，0.01 mmol)溶解于20 m L乙醇中，再加入3滴冰醋酸，接着，混合物在80℃下回流至原料点消失(约14 h)，反应完成后，待混合物冷至室温后，将混合物倒入100 m L碎冰中，有红色沉淀析出，收集并干燥粗品，用硅胶色谱柱纯化(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)，得到21 mg红色固体，产率38%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.70(s，1H)，11.31(s，1 H)，8.74(s，2H)，7.60(d，J＝8.1 Hz，1 H)，7.50(s，1 H)，7.46～7.36(m，2 H)，7.12～7.03(m，2H)，7.02～6.96(m，2H)，13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:153.99，140.63，134.29，133.11，132.95，129.32，129.29，129.20，128.26，128.04，109.99，55.99，40.30，33.31，29.66，18.66。HRMS(ESI):calculated for C27H24N4O2:[M＋H＋]:437.1971；Found:437.197 2。

1.7 探针检测限的计算

采用荧光分析法测定检测限.连续测定空白样品(W1，10μmol/L；VDMF/VPBS＝7/3，p H ＝7.4)的荧光强度11次，计算得到空白样品的标准偏差，再用下式计算求得检测限

式中XLOD是检测限，σ是连续十一次空白样品的标准偏差，k是线性方程的斜率。

2 结果与讨论

2.1 测试条件的优化

为了更好的研究探针分子对Cu2＋的识别体系，测试了探针分子在N，N 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈(ACN)、四氢呋喃(THF)这几种能和水以任意比互溶的溶剂中探针分子的荧光发射，从图1(a)可看出，探针分子在DMF溶剂中荧光发射最强，这是由于探针W1在DMF中拥有良好的溶解性，其作为极性非质子溶剂不会干扰探针分子本身存在的激发态分子内质子转移(ESIPT)，且DMF 溶剂极性相对较强，探针分子本身存在分子内电荷转移(ICT)，DMF 溶剂中能促进这种分子内电荷转移且分子内电荷转移的激发态在大极性溶剂中更加稳定，因而探针W1在DMF溶剂中荧光更强。除此之外，探针分子拥有席夫碱结构，应该存在聚集诱导发光(AIE)效应，为此，我们研究了探针分子在良溶剂(DMF)，不良溶剂(H2O)不同比例下的荧光发射，如图2(b)所示那样，结果表明，在DMF/H2O(7/3，v/v)体系下荧光发射最强，当水分数从10%增加到30%时，探针分子的荧光发射逐渐增强，这是由于不良溶剂的增加致使探针分子逐渐聚集，亚胺键的异构化被抑制，使得非辐射能量耗散降低[14](AIE 效应)；而当探针分子从30%增加到90%时，荧光逐渐降低，这是由于水分的进一步增加，导致探针分子更加聚集，形成了H-聚集体[15]。因此，我们之后的荧光测试都在DMF/PBS(7/3，v/v)体系中进行。

图1 探针W1的合成

图2 (a) 探针W1在不同溶剂中的荧光发射; (b) 探针W1在不同DMF/H 2 O 比例体系中的荧光发射

2.2 探针W1对Cu2+的选择性识别

如图3所示，进一步研究了探针W1对金属离子的响应，在(DMF/PBS，7/3，v/v)体系中，分别加入十倍Cu2＋当量的金属离子(Ag＋、Na＋、K＋、Mg2＋、Fe3＋、Al3＋、Ca2＋、Zn2＋、Cr3＋、Pb2＋、Hg2＋、Ba2＋、Co2＋、Ni2＋)，可以看出，探针分子对上述金属离子几乎没有响应，而1倍当量Cu2＋的加入却使得探针W1的荧光降至原来的十分之一。表明这些金属离子与探针分子存在的相互作用力非常弱，对探针分子检测Cu2＋几乎没有干扰，所以探针W1对Cu2＋的识别具有良好的选择性。

图3 (a) 探针W1与不同金属离子响应的荧光曲线; (b) 探针W1与不同金属离子响应的柱形图

2.3 探针W1对Cu2+的时间响应及其在不同p H 下对Cu2+的识别探究

按照1.1节实验条件，在(DMF/PBS，7/3，v/v)体系中探究了过量Cu2＋加入探针W1探针溶液中时的荧光发射光谱图4(a)，由图4可见，在加入Cu2＋后荧光迅速猝灭，仅120 s后探针分子的荧光强度已经降至稳定且不再变化，这表明探针W1可以迅速识别Cu2＋。为了研究不同p H 下探针分子对Cu2＋的识别，用不同比例的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠调节PBS缓冲体系的p H 为3～11，在(DMF/PBS，7/3，v/v)体系中测试了不同p H 下的探针分子及加入1当量Cu2＋后的荧光发射，结果表明，在p H 4～10的范围内，探针W1对Cu2＋的识别良好，而p H＝3时由于酸效应的影响导致其识别效果略微降低，p H＝11时则由于Cu2＋部分水解导致荧光不能完全猝灭。

图4 (a) 探针W1对Cu2＋的时间响应; (b) 探针W1在不同p H 下对Cu2＋的识别

2.4 探针W1对Cu2+的荧光滴定实验

图5和图6为探针W1对Cu2＋的荧光滴定得到的曲线，从图5可看出，在0～12μmol/L的Cu2＋中，探针W1的荧光发射逐渐降低，当Cu2＋浓度与探针分子浓度接近1∶1时，荧光强度的改变变得非常小。图6(a)为W1与Cu2＋滴定的线性拟合曲线，在Cu2＋浓度0～6×10－6mol/L之间呈现良好的线性关系，线性方程为y＝－4.91x＋367.49，R2＝0.9921。由连续11次空白探针W1的荧光强度标准偏差算出探针W1对Cu2＋的检测限为2.9×10－8mol/L；图6(b)是用等摩尔连续递变法测定探针W1与Cu2＋的配位比，首先，固定探针W1与Cu2＋的总浓度为20μL，改变二者的比例来测定探针W1与Cu2＋的配位比，结果表明，探针W1与Cu2＋在1∶1时荧光已经降至最低，说明其配位比为1∶1。

图5 (a) 探针W1对Cu2＋的荧光滴定曲线; (b)Cu2＋滴定的非线性拟合曲线

2.5 探针W1对Cu2+的可视化检测

在探针W1的DMF溶液中加入不同当量的Cu2＋时，如图7(a)所示那样，探针W1溶液的颜色也随之改变，探针W1可以很好地用于Cu2＋的可视化检测。同时，制备了探针W1的滤纸条用以快速检测Cu2＋，将干净的滤纸条浸泡在探针W1的DMF溶液中(10－4mol/L)，待其充分附着后，放入真空烘箱中干燥，向上滴加Cu2＋，发现试纸迅速变为棕褐色，且无需在紫外灯的照射下即可肉眼识别，表明该法成本低廉、识别迅速，具有良好的实用价值。

图7 (a) 探针W1加入不同当量Cu2＋时的溶液颜色变化(10－5 mol/L); (b) 探针W1的显色试纸用于可视化检测Cu2＋

同时，将制备好的滤纸条在365 nm 紫外灯下照射，发现其呈现红色荧光，然后，向上滴加不同的金属离子(10－4mol/L)。当滴加Cu2＋后发现，探针W1的滤纸条荧光发射猝灭，且在365 nm 的照射下的滤纸条颜色发生明显的改变，同样也证明了探针W1具有成本低廉、专一高效可视化检测Cu2＋的能力。

图8 探针W1的滤纸条加入不同金属离子时在365 nm 下对Cu2＋的专一性可视化识别

2.6 探针W1识别Cu2+的机理

Cu2＋具有强顺磁性，而探针W1分子存在分子内电荷转移(ICT)，当探针W1分子与Cu2＋配位后，由于Cu2＋的顺磁性能够使探针分子的电荷转移至Cu2＋(配体-金属电荷转移，LMCT)，导致荧光团从S1到T1态的系间窜越(ISC)速度加快，并由双分子非辐射过程(顺磁效应)失活，使得探针分子荧光团的ICT 激发态猝灭[16，17]，同时酚羟基到亚胺键的激发态分子内质子转移(ESIPT)也被抑制，所以产生了螯合荧光猝灭[18](CHEQ)。

3 结论

以二氰基异佛尔酮为母体，设计合成了高灵敏、高选择性响应Cu2＋的近红外荧光探针W1，W1拥有大的Stokes位移(252 nm)和近红外的荧光发射(668 nm)，对Cu2＋的检测限低至2.9×10－8mol/L，并且探针W1还能在自然光下肉眼识别Cu2＋，滤纸条实验也证明了其拥有肉眼快速可视化检测Cu2＋的实用价值。