脂噬在肾脏疾病中的作用研究进展

商益玮 何强

长期以来，人们认为脂质不能作为自噬底物被选择性降解，直到2009年Singh等[1]在培养的肝细胞中第一次明确定义了自噬在调节细胞内脂质储存中的作用。随后，脂噬在下丘脑细胞、纹状体神经元、胶质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和肠细胞等不同种类的细胞中也被发现[2-5]。在不同类型的细胞中，脂噬对脂质稳态起了重要的调节作用，并且与许多疾病的病理、生理有关。脂质的异常累积也参与了许多肾脏疾病的病理过程，且大多数肾脏疾病目前并无根治方法，通过寻找可靠靶点改善相关疾病的脂质累积，或许能成为延缓疾病发展，改善疾病预后的可靠途径。本文就脂噬在肾脏疾病中的作用研究进展，包括脂噬维持肾脏生理功能、降低肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,CCRCC）和糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）中脂质累积的作用作一综述。

1 脂噬的概述

1.1 自噬 自噬是由Ashford等[6]在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的。1963年De Duve[7]将自噬描述为细胞的某些部分不知何故在细胞自身的溶酶体中找到了自己的路径，并被分解。自噬是细胞在一定刺激下将其细胞内物质传递到溶酶体并在溶酶体中降解的动态过程。哺乳动物中有3种主要的自噬类型，包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[8]。巨自噬是最普遍的自噬形式，在此过程中，细胞形成一个称为自噬体的双膜隔离室，成熟为自噬体。这是巨自噬最明显的特征，并且有许多研究者认为在电镜下观察这种现象是判断巨自噬活性的“金标准”。自噬体在输送到液泡或溶酶体后，内容物被降解，产生的大分子被释放回细胞质中供再次使用[9]。巨自噬的底物包括多余和受损的细胞器、胞质蛋白、部分细胞核、入侵微生物甚至溶酶体本身，以适应细胞面对的各种应激条件，包括饥饿、缺氧、激素刺激和微生物入侵，以此来保护细胞[10]。相反，微自噬不涉及自噬体作为运输中间产物，而是由溶酶体单独以溶酶体包裹机制完成吞噬过程[11]。而热激同源蛋白70（heat shock cognate protein 70,HSC70）通过微自噬可以介导选择性的蛋白降解[12]，微自噬的主要作用是维持细胞器的大小、膜内稳态和氮限制下的细胞存活。微自噬与巨自噬、分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）和其他自噬途径相互协调并互为补充[13]。CMA是目前研究较少的一种自噬类型。CMA以蛋白质为唯一降解底物，蛋白质必须在其氨基酸序列中包含特定的靶向基序才能成为CMA底物，该基序与HSC70结合，后者将底物蛋白带到溶酶体表面内化然后进行快速的溶酶体内降解[14]。CMA通过降解受损蛋白质，有助于细胞质量控制。此外，CMA还能降解未受损的蛋白质以终止其功能，通过这种方式，它有助于调节多种细胞活动（包括T细胞活化、细胞周期、细胞代谢、细胞生长和存活等）[15]。非选择性自噬用于饥饿条件下大量细胞质的转换，而选择性自噬专门针对受损或多余的细胞器以及入侵的微生物。根据特定细胞器的不同，选择性自噬拥有各种特征性的名字，比如以线粒体为目标的线粒体自噬（mitophagy）、以内质网为目标的内质网自噬（ER-phagy）、以溶酶体为目标的溶酶体自噬（lysophagy）和以脂滴（lipid droplets,LDs）为目标的脂噬等[16]。

1.2 脂噬 LDs是可以储存脂质的真核细胞器。脂噬是指LDs被自噬体隔离，与溶酶体融合形成自噬溶酶体。LDs中的TG和胆固醇酯随后被自溶酶体中的溶酶体水解酶降解为游离脂肪酸（free fatty acids,FFAs），这些FFAs被再循环回细胞质中进行线粒体β-氧化[17]。脂噬主要是通过巨自噬和CMA两种途径完成的。脂肪组织甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）和磷脂酶patatin样域包含蛋白8（patatinlike phospholipase domain-containing enzyme 8,PNPLA8）被认为是脂噬的选择性自噬受体[18-19]。自噬相关基因（autophagy related gene,ATG）14内的磷酯酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）与Unc-51样自噬激活激酶1（unc-51-like kinase 1,ULK1）和微管相关蛋白Ⅰ轻链3（microtubule associated protein Ⅰ light 3,LC3）相互作用，诱导脂噬，导致FFAs的释放。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）可以通过抑制雷帕霉素靶蛋白促进自噬起始复合物（ULK1、ATG13、ATG101、200 kDa的FAK家族激酶相互作用蛋白）的表达从而调节脂噬。CMA同样也在脂噬中起到了重要作用，CMA可以通过HSC70和溶酶体相关膜蛋白2A（lysosomeassociatedmembraneprotein2A,LAMP2A）受体的协同作用降解LDs的外壳蛋白脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN）2和PLIN3，从而调节细胞内的脂质储存[20]。Kaushik等[21]发现，CMA活性受损时，无法从LDs表面移除PLIN，会阻止ATGL和自噬相关蛋白进入脂质核心，并通过两种途径（胞质脂肪酶和巨自噬）的调节抑制脂肪分解。不同的PLIN成员似乎可以识别不同大小或成熟状态的LDs进行结合[22]，但至今每个PLIN家族成员调节脂噬的机制尚未明确。脂噬作为一种选择性自噬，对LDs降解的调节作用已得到充分证明，在营养缺乏或者细胞脂质积聚过多时，脂噬可以被刺激，从而降解LDs并为细胞提供能量来源。在不同类型的细胞中，脂噬对脂质稳态起了重要的调节作用，并与酒精性和非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝细胞癌、动脉粥样硬化等多种疾病的病理生理有关[23-27]（图1）。

图1 脂噬的模式图（LDs表面蛋白PLIN2和PLIN3在CMA途径中被HSC70识别并结合形成复合物，HSC70和PLIN复合物与LAMP2A结合，导致它们被溶酶体摄取并降解。这有助于其脂质核心进入胞质脂肪酶ATGL降解或被自噬小体锚定进入巨自噬途径被降解。在巨自噬途径中经过隔离膜形成、隔离膜的伸长和闭合导致自噬体的形成、自噬体随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体等，最终被吞噬的LDs降解为FFAs成为供能来源）

2 脂噬与肾脏生理

肾脏虽然只占人体0.5%的体重，但其耗氧量却占到了人体总耗氧量的10%。FFAs的β-氧化是肾ATP产生的主要来源，尤其是在近端小管，因为近端小管具有较高的能量需求和相对较小的糖酵解能力[28]。FFAs是代谢中间产物，可通过饮食获得或内源性合成。它不仅是脊椎动物能量生产的最有效基质，也是构成生物膜脂质的基本成分[29]。除了作为一种重要的能源外，它还产生各种有益和有害的影响，通过与核受体或膜受体结合在调节代谢途径的信号分子中发挥重要作用。然而，在FFAs超负荷的情况下，它们会变得有毒，诱导活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生、内质网应激、细胞凋亡和炎症[30]。LDs的存在不仅可以作为能量储存的仓库，还可以防止由FFAs过量产生的细胞毒性，而这些储存的能量可以通过脂肪酶的活性迅速降解。根据目前的研究，主要有3种脂肪酶参与LDs中TG的降解：ATGL、激素敏感性脂肪酶和单酰甘油脂肪酶，分别在降解途径中催化TG、甘油二脂和单酰甘油[31]。但最近的研究表明，在肾脏LDs的降解中，除了传统的脂肪分解外，脂噬也发挥着重要作用。Minami等[32]发现，在长期饥饿时，肾近端小管细胞的免疫荧光中可以看到氟硼二吡咯标记的LDs和微管相关蛋白1A/1B轻链3B标记的自噬体的共定位明显增多，并且使用自噬抑制剂氯喹后，共定位增多更加明显。说明在长期饥饿的情况下肾近端小管细胞发生了脂噬，电子显微镜的观察结果也印证了这一现象。使用ATP比色/荧光分析试剂盒和细胞活力测定四氮唑蓝法检测发现，对照组比脂噬抑制组（atg5-/-）ATP含量和细胞存活率更高。经过可以促进LDs形成的油酸处理后，对照组ATP含量再次上升，而脂噬抑制组无变化。说明在长期饥饿时，脂噬可以维持肾近端小管的能量稳态，提高肾近端小管的存活率。并且该研究还发现在肾脏中脂噬和传统的自噬具有不同的阶段周期，但脂噬和传统自噬之间的分子转换机制仍有待阐明。

3 脂噬与CCRCC

CCRCC是成人肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）的最常见形式，约占RCC的75%。CCRCC的一个明确的形态学特征是脂质的异常细胞质积累，包括胆固醇、胆固醇酯和中性脂质，这一特征是“透明细胞”名称的由来[33]。近35%的肾切除术后CCRCC患者有局部浸润或远处转移，需要进一步化疗或放疗，不幸的是，CCRCC对目前的化疗和放疗方式并不敏感[34]。Wettersten等[33]发现CCRCC通常伴随着葡萄糖和脂肪酸代谢以及三羧酸循环的改变，这些变化为CCRCC新的治疗策略、生物标志物和成像方式提供了机会。研究证明，脂质代谢在肿瘤生长和转移中具有关键作用，而他汀类等药物可以通过干扰脂质代谢影响肿瘤生长[35]。微管相关蛋白1S（microtubule associated protein1S,MAP1S）是微管相关蛋白家族1的成员，可以与LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ亚型相互作用，已被证实是自噬的积极调节因子[36]。Xu等[37]发现正常组织、癌旁组织和CCRCC组织中MAP1S含量呈递减变化，并且拥有更好预后的CCRCC患者MAP1S水平往往更高。在小鼠肾上皮细胞中，敲除MAP1S基因后发现自噬通量下降，脂质累积也伴随增多，转染MAP1S基因后发现自噬通量上升，脂质累积伴随减少。说明由MAP1S缺陷引起的脂噬缺陷可能促进CCRCC的发生和发展，降低CCRCC患者的生存率。而提高MAP1S的表达可以通过增强脂噬作用改善CCRCC患者的预后。近年来，首次从传统中草药雷公藤根中分离出的活性成分雷公藤红素已被发现在各种癌症中的潜在抗肿瘤特性，包括胃癌、鼻咽癌和肝细胞癌[38-40]。Zhang等[41]发现，雷公藤红素可以浓度依赖性地通过上调肿瘤组织中的肝X受体α和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)增强脂噬作用以及促进ABCA1介导的胆固醇外流改善CCRCC患者的脂质累积，抑制上皮-间质转化的进展，最终抑制细胞增殖、迁移和侵袭以及肿瘤生长。但脂噬作用的增强在CCRCC中并不全是正向作用。索拉非尼作为CCRCC治疗的一线药物长期被其获得性耐药机制所困扰[42]。Liu等[43]研究显示，与非耐药细胞相比，索拉菲尼耐药细胞具有较高的自噬水平，LDs储存水平降低，FFAs含量上升，并且自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）的使用可以降低其耐药性，表明索拉非尼耐药细胞可能通过增强脂噬作用代谢LDs以适应肿瘤细胞大量的能量消耗。而蛋白激酶B通路在耐药细胞中被明显激活，可能对自噬起负调控作用，使耐药细胞不至于过度自噬。

4 脂噬与DKD

DKD是糖尿病的一种严重并发症，已成为世界范围内最常见的导致慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和终末期肾病的原发疾病，也与心血管疾病和高昂的公共卫生保健费用有关[44]。尽管有研究表明肾小球肾炎是发展中国家导致CKD更主要的病因[45]，但根据Zhang等[46]的研究，在最近几十年中国糖尿病患病率不断上升的背景下，中国普通人群和城市住院人群与糖尿病相关的CKD比与肾小球肾炎相关的CKD更为常见。DKD的特征是GFR降低、肾小球肥大、蛋白尿、肾小球基底膜增厚、系膜扩张、足细胞减少、肾小球硬化和间质纤维化[47]。导致DKD发生、发展的机制目前尚不清楚，尽管血糖控制和肾素-醛固酮系统拮抗剂有一定的作用，但大多数DKD患者的病情仍会进展。遗传学因素可能在DKD发生、发展中起关键作用，但除此之外，血脂的异常代谢可能也是一个重要机制[48]。血浆中TG和FFAs水平过高会导致非脂肪组织中的脂质积累和脂毒性[49]，并且肾脏细胞会因异位脂质沉积而受损，与DKD肾脏中的炎症、ROS生成、线粒体功能障碍和细胞死亡有关[50]。据此，脂噬可能通过清除肾脏的脂质累积对DKD的进展起调控作用。Han等[51]发现电镜下可以看到DKD患者肾脏切片LDs数量和大小明显多于对照组，自噬体数量少于对照组，并且免疫荧光显示DKD患者自噬相关蛋白表达也明显低于对照组，说明在DKD患者的肾脏中，脂噬显著减弱了。研究证实脂联素可以激活AMPK和过氧化物酶体增殖物激活受体-α通路上调自噬水平[52]。在db/db DKD小鼠模型中使用脂联素受体激动剂Adipo-Ron后发现自噬相关蛋白明显上调、脂噬作用增强，并且DKD小鼠的肾脏损伤、细胞凋亡、ROS含量、脂质沉积都明显好转。更出乎意料的是，通过对纤维化相关的纤维粘连蛋白和Ⅰ型胶原进行标记，发现加强脂噬作用对DKD患者肾脏的改善作用不仅发生在脂质沉积上，也发生在纤维化上[51]。Lee等[53]发现给DKD小鼠补充维生素D3可以上调脂噬表达，从而改善DKD患者的生化指标和肾脏损害。脂噬缺陷在DKD的脂质沉积和脂肪相关的肾损害中至关重要。因此，脂噬作用的加强有望成为治疗DKD或者延缓其发展的一大靶点。

5 小结

脂噬在肾脏的生理和病理过程中具有一定的调控作用，可以清除肾脏的脂质累积并为饥饿状态下的肾脏提供能量来源。在许多与脂质累积相关的肾脏疾病中，脂噬可以通过对脂质的清除作用改善疾病的进展和预后。但目前对脂噬作用机制的研究仍不完善，比如在索拉非尼耐药的CCRCC细胞中，通过乌苯美司促进细胞脂噬或通过3-MA抑制脂噬都可导致耐药细胞耐药性的减弱[43]。且目前的研究多关注于脂噬对单一器官或细胞的作用，但许多疾病的改变并不是发生在单一器官上的，脂噬的作用也并不止于此，比如脂噬不仅可以作用于DKD的脂质沉积，也有大量证据证明脂噬对糖尿病的胰岛抵抗也有改善作用[54]。因此，脂噬对肾脏的确切机制和与整个机体的动态关系有待于进一步探索。