迷走神经C传入纤维通路在胃食管反流性咳嗽中的作用

平明芳 杨霞 刘伟荣 顾伟忠 舒小莉 江米足

慢性咳嗽是影响人们生活质量的最常见的临床问题之一，全世界约有10%的人受到慢性咳嗽的困扰[1-3]。胃食管反流性咳嗽（gastroesophageal reflux cough,GERC）是引起慢性咳嗽的三大病因之一[4]。胃食管反流的主要病理生理特征是酸反流，抑酸治疗可使部分GERC患者咳嗽症状得到缓解，但也有很大一部分患者即使抗酸治疗仍有持续的咳嗽症状[5-7]。目前抗酸治疗无效的GERC是临床上一个棘手的问题[8-9]。GERC主要与食管-支气管神经反射及气道高反应性有关，两者均与迷走神经通路介导的神经反射引起气道神经源性炎症相关[10-11]，但具体的通路及机制尚不清楚。本研究通过建立GERC大鼠模型，观察迷走神经C传入纤维通路在GERC中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 普通级健康雄性Wistar新生大鼠45只，体质量5～6 g，购于浙江大学实验动物中心，所有新生大鼠均喂养至8周。饲养于清洁级环境下，实验过程中所有的操作都严格遵守《实验动物管理条例》。

1.2 仪器与试剂 微量紫外分光光度计（Nano-Drop®ND-1000）、ABI 7500荧光定量PCR仪（美国赛默飞公司）；辣椒素（上海广锐生物科技有限公司）；胃蛋白酶、琼脂糖、乌拉坦、乙酰甲胆碱（methacholine,Mch）（日本Sigma公司）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司）；盐酸氯胺酮注射液（福建古田药业集团）；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate,DEPC）水（上海生物工程技术有限公司）；6×电泳上样缓冲液、SYBR Premix Ex TaqⅡ（Perfect Real Time）、引物、Trizol、反转录试剂盒、支气管激发试验相关试剂（日本Takara公司）。

1.3 造模方法和分组 采用随机数字表法将45只大鼠分为4组，R1组大鼠10只，实验过程中死亡1只；R2组大鼠10只，实验过程中死亡3只；R3组大鼠15只，实验过程中死亡6只；R4组大鼠10只，实验过程中死亡2只。R1组：阳性对照组（盐酸灌注组）；R2组：暂时性食管迷走神经C传入纤维变性型实验组；R3组：持久性食管迷走神经C传入纤维变性型实验组；R4组：阴性对照组（0.9%氯化钠溶液灌注组）。每次实验操作前，各组大鼠灌注盐酸之前均先腹腔注射500 mg/kg盐酸氯胺酮注射液进行轻度麻醉，然后用5 F胃管经口插至食管中下段，并将微量注射泵与胃管外端相连。R1组：新生大鼠饲养到8周龄后将浓度0.1 mol/L盐酸溶液置于注射泵中缓慢灌注，速率为18 ml/h，20 min/次，1次/d，连续2周。R2组：新生鼠饲养到8周龄后皮下注射50 mg/kg辣椒素，连续2 d，连续酸灌注2周（灌注方式同R1组）。R3组：新生鼠生后2 d皮下注射50 mg/kg辣椒素，连续2 d，8周龄后连续酸灌注2周（灌注方式同R1组）。R4组：新生大鼠饲养到8周龄后连续食管内0.9%氯化钠溶液灌注2周（灌注方式同R1组）。

1.4 支气管激发试验 最后1次食管灌注24 h后，使用25%乌拉坦（按1.2 mg/kg剂量）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后完成气管插管，并将大鼠移到体积描记器内。通过分析体积描记器相连接的生物信号记录测定跨肺压、基础潮气量及气道流速，然后将0.9%氯化钠溶液、Mch分别装入雾化罐后连接气管插管雾化刺激大鼠30 s，Mch 激发浓度分别为 0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L，观察用不同浓度Mch行支气管激发试验后大鼠的跨肺压、潮气量及气道流速的变化情况。计算公式：肺阻力（cmH2O·ml-1·s-1）=跨肺压/气道流速；动态肺顺应性（ml/cmH2O）=潮气量/跨肺压；肺阻力增加百分比=（激发后肺阻力-基础肺阻力）/基础肺阻力×100%；动态肺顺应性减少百分比=（基础动态肺顺应性-激发后动态肺顺应性）/基础动态肺顺应性×100%。

1.5 标本收集与病理检查 各组小鼠在完成激发试验后，腹腔注射25%乌拉坦（按0.6 mg/kg剂量）补充麻醉，断头处死。取气管组织、右侧肺近肺门约0.5 cm处肺组织及食管下端近括约肌处0.5 cm食管组织，放在10%多聚甲醛中12 h，固定，用石蜡包埋、切片、制片，并用HE染色处理标本。

1.6 肺组织神经激肽受体1（neurokinin 1 receptor,NK1R）、神经激肽受体2（neurokinin 2 receptor,NK2R）、神经激肽受体3（neurokinin 3 receptor,NK3R）及食管组织5-羟色胺受体3（5-hydroxytyptamine receptor 3，5-HT3R）、瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid receptor 1,TRPV1）、酸敏感离子通道3（acid-sensing ion channel 3,ASIC3）mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。采用Trizol法分别提取肺组织和食管组织总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书操作。用微量紫外分光光度计（NanoDrop®ND-1000）检测肺组织、食管组织总RNA纯度和含量。6个目的基因的上下游引物序列及产物长度见表1。在ABI 7500型实时荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法计算 NK1R、NK2R、NK3R、5-HT3R、TRPV1和 ASIC3 mRNA表达水平。

表1 6个基因的上下游引物序列及产物长度

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠肺阻力及顺应性的变化与比较 当Mch浓度升到0.25、0.5 mmol/L时，R1组大鼠肺阻力增加百分比明显大于R2组、R3组、R4组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。当Mch浓度升到0.5 mmol/L时，R1组大鼠动态肺顺应性减少百分比大于R2组、R3组及R4组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示大鼠气道反应性增高，见图1。

图1 Mch刺激后4组大鼠肺阻力和肺顺应性的变化与比较

2.2 4组大鼠气管、肺和食管组织病理学改变的比较 病理检查发现，与R2、R3和R4组比较，R1组大鼠气管组织、肺组织及食管组织的炎症性病变更为明显，见图2-4。

图2 4组大鼠气管组织病理变化的比较（a：R1组气管组织纤毛柱状上皮增生增厚明显，排列紊乱，部分脱落，黏膜下层血管出血性充血明显，炎症细胞浸润明显；b-c：R2、R3组气管纤毛柱状上皮有少许脱落，有少许炎症细胞浸润；d：R4组气管结构清晰，白细胞分类基本正常，未见明显炎症细胞浸润和血管充血；HE染色，×100）

图3 4组大鼠肺组织病理变化的比较（a：R1组肺组织的炎症细胞浸润明显增多，小气道管壁增厚，气道狭窄，分泌物增多；b-c：R2、R3组肺组织中炎症细胞轻度增多；d：R4组肺泡结构正常；HE染色，×100）

图4 4组大鼠食管组织病理变化的比较（a：R1组食管鳞状上皮增厚，上皮基底层乳头延长，固有层炎症细胞浸润明显；b-c：R2、R3组食管鳞状上皮轻度增厚，上皮基底层呈波浪形，固有层见轻度炎症细胞浸润；d：R4组食管鳞状上皮结构基本正常，炎症细胞不明显；HE染色，×100）

2.3 4组大鼠肺组织中NK1R、NK2R、NK3R mRNA表达水平比较 4组大鼠肺组织中NK1R、NK2R mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），R3组大鼠肺组织中NK3R mRNA表达水平高于R1组、R2组和R4组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

图5 4组大鼠肺组织中NK1R、NK2R、NK3R mRNA表达水平比较

2.4 4组大鼠食管组织中5-HT3R、TRPV1和ASIC3 mRNA表达水平比较 4组大鼠食管组织中5-HT3R、TRPV1和ASIC3 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图6。

图6 4组大鼠食管组织中5-HT3R、TRPV1和ASIC3 mRNA表达水平比较

3 讨论

现有研究表明GERC发病的机制包括食管-支气管神经反射及气道高反应性[12]，它们均与迷走神经C传入纤维通路有关[13]。迷走神经支气管肺C类神经纤维是一种广泛分布在支气管、肺部的伤害感受器，它对许多炎症介质如缓激肽、5-羟色胺及TRPV1受体激活剂特别敏感[14]。触发支气管肺C纤维伤害感受器可引起神经肽如P物质（substance P,SP）、神经肽A（neurokinin A,NKA）、神经肽B（neurokinin B,NKB）的释放，当神经肽物质大量释放时可以诱发神经源性炎症，主要临床表现为咳嗽、黏液分泌增加、心动过缓甚至呼吸暂停。临床研究表明GERC患者质子泵抑制剂及促胃动力剂治疗4周后，如果咳嗽明显缓解、血浆和痰SP水平明显增高，需考虑与神经源性炎症相关[15]。动物实验发现给豚鼠及兔的食管灌注盐酸，可以激发其气道神经源性炎症，当使用NK1R和NK3R阻断剂后可以明显抑制这种炎症的产生[16-18]。既往研究认为迷走神经传入通路中的感觉纤维也在调节咳嗽反射中起着重要作用[19]。Chen等[20]在豚鼠的食管下段内注射盐酸溶液，发现行迷走神经切断术组豚鼠血浆中SP浓度和气道微血管渗漏均低于其他组，表明迷走神经可能介导了由食管-支气管反射引起的GERC的气道炎症。本研究通过对大鼠进行盐酸食管内持续灌注2周，结果发现在显微镜下R1组食管鳞状上皮增厚，上皮基底层乳头延长，固有层炎症细胞浸润明显。通过支气管激发试验检测大鼠肺阻力和顺应性时发现，当Mch浓度升到0.25及0.5 mmol/L时，R1组大鼠肺阻力增加百分比明显高于R2、R3和R4组，而当Mch浓度升到0.5 mmol/L时，R1组大鼠动态肺顺应性减少百分比明显高于R2、R3和R4组，上述表型提示盐酸灌注后大鼠气道反应性增高，对环境的刺激阈值降低，在受到外界有害的环境刺激物刺激时更易出现咳嗽及气促、胸闷等症状，提示迷走神经通路在GERC中起着重要作用。进一步肺部研究发现，与其他3组相比，R3组NK3R mRNA表达水平明显升高，考虑迷走神经持久变性后，盐酸灌注后未能引起大鼠肺内NKB增多，而大鼠肺内NK3R表达明显增多，使NKB更容易与NK3R结合，让NKB更大地发挥其作用，提示迷走神经C传入纤维在GERC中的重要作用，综合迷走神经对有害刺激的反应，考虑迷走神经C传入纤维是GERC的主要传入纤维。

综上所述，大鼠食管酸灌注模型可以引起食管组织的黏膜损伤、气道高反应性以及气道神经源性炎症。食管酸灌注及持久迷走神经C纤维损伤可引起肺组织内NK3R增高，迷走神经C传入纤维通路可能在GERC中起着重要作用。本实验不足之处是未对肺组织内的神经肽SP、NKA、NKB含量进行直接测定，这将在后续的研究中进一步完善。