UBE2B在食管癌组织中的表达及其与上皮-间质转化和转移的关系

施谷平 孙宇

食管癌是我国常见的一种消化道肿瘤，具有恶性程度高、易复发、预后差等临床特点[1]。近年来，虽然食管癌的综合治疗水平得到了明显提升，但患者的生存率仍然较低[2]。研究证实食管癌的发生、发展是一个多阶段的复杂过程，多种癌基因和抑癌基因异常表达参与其中[3-4]。因此，深入研究食管癌的分子机制具有十分重要的作用。泛素结合酶E2B（Ubiquitin conjugating enzyme E2 B,UBE2B）是泛素化家族成员之一[5]。越来越多的研究证实，UBE2B参与多种人类恶性肿瘤，如口腔鳞状细胞癌、直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等癌症的发病过程[6-8]。然而，目前有关UBE2B在食管癌中的作用研究较少见。本研究主要探讨UBE2B在食管癌中的表达情况及其临床意义，并且初步研究UBE2B在食管癌中的生物学功能。

1 材料和方法

1.1 实验材料 包含34对食管癌组织及配对癌旁组织的食管癌组织芯片（EC-1402）购自武汉赛维尔生物科技有限公司。人食管癌细胞株Eca-109购自中科院上海细胞库。UBE2B抗体、上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）抗体、神经性钙黏附蛋白（N-cadherin）抗体、Slug抗体、Snail抗体均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记羊抗人的IgG、支原体检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、硝酸纤维素膜均购自上海碧云天生物技术有限公司；RPMI 1640培养基、Transwell小室（8 μm孔）均购自美国Corning公司；FBS购自美国Hyclone公司；Lipofectamine 3000、Matrigel胶、蛋白酶与磷酸酶抑制剂均购自美国Thermo Fisher公司；BCA定量试剂盒购自美国BIO-RAD公司；UBE2B特异性敲低靶向siRNA及对照siRNA均购自上海生工生物工程有限公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司；倒置荧光相差显微镜（型号：CKX53）购自日本Olympus公司；实时荧光定量PCR系统（型号：ABI Step One Plus）购自美国ABI公司；垂直电泳仪（Power Pac Basic）和蛋白转印模块（Mini Trans-Blot Cell）均购自美国Bio-Rad公司；低温离心机（型号：Thermo Scientific MicroCL 21R）购自美国Thermo Fisher公司；凝胶成像系统（型号：BIO-RAD Gel Doc XR+）购自美国BIO-RAD公司。

1.2 生物信息分析 从癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库（https://www.cancer.gov）下载食管癌患者临床信息及转录组测序（RNA sequencing，RNA-Seq）数据，利用R语言进行分析。比较食管癌组织与正常组织中UBE2B mRNA的表达差异。根据表达中值将食管癌样本分为UBE2B高表达组和低表达组，比较两组患者生存差异。

1.3 UBE2B蛋白表达检测 采用免疫组化法。组织芯片置于65℃烘箱中烤片后，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡、脱水，0.01 mol/L柠檬酸（pH=6.0）缓冲液高压修复抗原8 min，3% H2O2去除内源性过氧化物酶10 min，滴加UBE2B抗体（1∶200），4℃孵育过夜，PBS冲洗。二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人的IgG，37℃孵育30 min，PBS冲洗。滴加二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱色，返蓝，脱水封固。结果判读采用双盲法：由两位病理科医师独立双盲阅片，结果取其平均值。每张组织切片在高倍镜下（×400）随机选取至少5个视野，每个视野计算＞200个细胞进行免疫染色结果判定。每张切片进行半定量记分，最终积分=细胞染色强度×阳性细胞百分比。细胞染色强度计分：无着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分比计分：＜5%为0分，＞5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%～100%为4分；最终积分0～3分为阴性，4～12分为阳性。

1.4 细胞转染 人食管癌细胞株Eca-109培养在含10%FBS的RPMI 1640培养基中，培养条件为37℃，5% CO2。当细胞融合度达到80%时传代培养，选取对数生长期的细胞用于实验。定期对细胞进行支原体感染的检测，从而保证细胞正常生长。将Eca-109细胞分别转染特异性靶向UBE2B的siRNA以敲减UBE2B的表达（si-UBE2B组）和非靶向对照siRNA（sicontrol组）。质粒转染按照Lipofectamine 3000说明书进行，具体如下：将Eca-109细胞接种到六孔板中培养，当细胞密度达到70%～80%时进行转染。首先将培养基分别与si-UBE2B以及si-control混合，同时将培养基与Lipofectamine 3000脂质体转染试剂混合，室温静置5 min，随后将si-UBE2B培养基混合液及si-control培养基混合液分别与Lipofectamine 3000培养基混合液相混合，混匀后室温静置5 min。将上述两组混合液分别加入六孔板中，继续放入37℃，5% CO2的恒温培养箱中培养48 h后，收集转染后的两种细胞进行下一步实验。

1.5 细胞迁移、侵袭能力检测 采用Transwell小室实验。迁移实验小室膜无Matrigel胶覆盖，而侵袭实验小室膜有Matrigel胶覆盖。收集转染成功的Eca-109细胞，并用无血清培养基制备细胞悬液，将100 μl细胞悬液（含5×104个细胞）接种在Transwell小室的上室中，下室则放置含有10%FBS的RPMI 1640培养基。放置培养箱中孵育24 h后，收集染色细胞。Transwell小室先用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗后干燥，置于显微镜下观察，选取4个低倍视野（×100）拍照并进行细胞计数，计算平均值。

1.6 细胞UBE2B及上皮-间质转化标志蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Slug和Snail）表达水平检测 采用Western blot法。将转染成功的Eca-109细胞，移去培养基后，PBS清洗3遍。将培养皿放置冰上，加入适量RIPA细胞裂解液裂解，使用细胞刮收集蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。样品蛋白经100℃高温变性后放入-80℃冰箱备用。将蛋白样经过10%SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗UBE2B抗体（1∶1 000）、E-cadherin抗体（1∶1 000）、N-cadherin抗体（1∶1 000）、Slug抗体（1∶1 000）、Snail抗体（1∶1 000）。4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，通过ECL化学发光法，在成像系统中扫描并分析结果。

1.7 统计学处理 采用Graphpad Prim 6.0统计软件。计数资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组织和正常组织中UBE2B mRNA表达水平及总体生存率比较 生物信息分析结果显示，与正常组织比较，食管癌组织中UBE2B mRNA表达水平较高（P＜0.01），见图1a。生存分析结果显示UBE2B高表达组患者总体生存率明显低于UBE2B低表达组（P＜0.01），见图1b。

图1 食管癌组织和正常组织中UBE2B mRNA表达水平及总体生存率比较（a：食管癌组织和正常组织中UBE2B mRNA表达水平比较，*P＜0.01；b：食管癌组织中UBE2B高表达组和低表达组患者总体生存率比较）

2.2 食管癌组织和正常组织中UBE2B蛋白的表达比较 组织芯片免疫组化结果显示，食管癌组织中UBE2B蛋白阳性表达率为76.47%（26/34），高于正常组织的29.41%（10/34），差异有统计学意义（χ2=15.1，P＜0.01），见图2。

图2 食管癌组织和正常组织中UBE2B蛋白的表达（免疫组化染色）

2.3 si-UBE2B组和si-control组细胞迁移和侵袭能力比较 与si-control组比较，si-UBE2B组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显降低（均P＜0.01），见图3和表1。

图3 si-UBE2B组和si-control组迁移和侵袭细胞的染色图

表1 si-UBE2B组和si-control组细胞迁移和侵袭能力比较（个）

2.4 si-UBE2B组和si-control组细胞上皮-间质转化标志蛋白表达水平比较 与si-control组比较，si-UBE2B组细胞上皮标志物E-cadherin明显升高，而间质标志物N-cadherin、Slug和Snail均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2和图4。

表2 si-UBE2B组和si-control组细胞上皮-间质转化标志蛋白表达水平比较

图4 si-UBE2B组和si-control组细胞上皮-间质转化标志蛋白表达的电泳图

3 讨论

食管癌在全球癌症相关死亡原因中排名第6位，严重威胁人类健康[9]。我国是食管癌高发国，食管癌患者主要集中在河南、河北等中原地区。食管癌主要分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌2种主要病理类型，我国绝大部分食管癌为食管鳞状细胞癌[1,10]。近年来，随着早期诊断、根治性手术和术后辅助治疗的快速发展，我国食管癌患者预后有了一定的改善，但总体5年总生存率仅为20%～40%[2]。食管癌患者预后差主要是由于早期转移和复发。研究表明上皮-间质转化是促进食管癌细胞侵袭和转移的重要通路[11-12]。因此，迫切的需要从分子水平研究食管癌的发生及其转移的分子机制，为食管癌的早期诊断及靶向治疗提高新的方向。

UBE2B是泛素结合酶E2家族的成员，参与细胞的分化、周期和代谢等多种生物功能[13-15]。越来越多的研究证实，UBE2B参与了肿瘤的发病过程。在结直肠癌中，UBE2B的异常高表达降低了肿瘤细胞对放疗的敏感性，影响肠癌患者的预后[7]。在口腔癌中，miR-455-5p通过UBE2B参与肿瘤的发展过程[6]。UBE2B通过调节O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶泛素化水平影响鼻咽癌细胞对化疗的敏感性[16]。但在食管癌中尚未研究报道。本研究中，首先应用生物信息分析技术分析TCGA数据库中食管癌RNA-Seq数据。分析结果显示UBE2B mRNA在食管癌组织中异常高表达，并且与不良生存预后显著相关。为了进一步验证上述分析结果，本研究应用食管癌组织芯片进行免疫组化实验，实验结果再次证实了UBE2B在食管癌组织中异常高表达。免疫组化结果和TCGA生物信息分析结果相互佐证了UBE2B在食管癌中发挥了癌基因的作用，促进食管癌的发生、发展。为了进一步研究UBE2B的生物学功能，siRNA用于敲低食管癌细胞Eca-109细胞UBE2B的表达。生物学功能实验表明，敲低UBE2B能够显著抑制Eca-109细胞的迁移能力。进一步深入研究，本研究发现敲低UBE2B能够显著增加上皮标志物E-cadherin蛋白的表达，降低间质蛋白标志物Slug、Snail和N-cadherin蛋白的表达。因此，UBE2B在食管癌中发生、发展中扮演了癌基因的重要角色。

综上所述，UBE2B异常高表达是食管癌患者生存的独立影响因素，有望成为判断预后的分子靶标。UBE2B主要通过调控上皮-间质转化过程促进食管癌的转移，为食管癌的治疗提高了新的思路。