烟碱促进慢性鼻窦炎患者鼻黏膜炎症变化的研究

张彬 徐明 贾旭锦 王卢莎 陈漫漫

慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis,CRS）是一种常见的病程超过12周的累及鼻腔、鼻窦黏膜的慢性炎症性疾病，多中心流行病学调查显示我国CRS的总体患病率为4.8%～9.7%，对患者生活质量及社会经济都造成严重影响[1]。CRS根据鼻黏膜组织内嗜酸粒细胞浸润程度不同分为嗜酸粒细胞性CRS（eosinophilic CRS,ECRS）及非嗜酸粒细胞性CRS（non-eosinophilic CRS,nECRS）[2]。与 nECRS患者相比，ECRS患者往往伴有更严重的疾病和较差的治疗结果[3]。ECRS患者血液和组织中嗜酸粒细胞增多，并表现出显著的嗜酸粒细胞性炎症[4]。因此，如何在CRS内在表型研究的基础上，阐明CRS发病的分子机制，进而阻断其发病机制，开展精准医疗，提高疗效，成为鼻科医生面临的紧迫任务。但至今CRS的发病机制仍不明确，且不同内在表型CRS的发病机制也不尽相同。笔者团队既往研究发现ECRS与吸烟呈正相关[5-6]，但是吸烟促进ECRS发生、发展的机制尚不明确。因此，本研究主要通过原代鼻黏膜上皮细胞（nasal epithelial cells,NEC）模型探讨烟碱促进CRS患者鼻黏膜炎症变化的机制。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019年7至12月在宁波大学医学院附属医院住院的CRS患者16例，其中男12例，女4例；年龄21～67（42.38±12.74）岁。所有患者既往均无哮喘病史。纳入标准：（1）有以下2种或2种以上症状：鼻阻塞、流涕或鼻涕倒流、头晕头痛、嗅觉减退或障碍，持续3个月以上；（2）鼻内镜检查双侧中鼻道有息肉样组织，来源于鼻道窦口复合体或窦内黏膜。排除标准：鼻窦炎急性感染期、后鼻孔息肉、息肉内有纤维囊泡病变、真菌性鼻窦炎伴息肉以及纤毛不动综合征。本研究经宁波大学医学院附属医院医学伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和培养液 DMEM培养基、胰酶、BEGM培养液及FBS均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；人IL-3、IL-5及 IL-8 ELISA Kit、人嗜酸粒细胞趋化蛋白 2（eosinophil chemotactic protein 2,eotaxin-2）ELISA Kit及人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）ELISA Kit等购自上海麦克林生化科技有限公司；CCK-8 ELISA Kit购自和元生物技术（上海）股份有限公司。Multiskan FC酶标仪购自上海腾名生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NEC原代培养 将新鲜CRS患者钩突黏膜组织样本放入含双抗（100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）4℃无菌的PBS中冲洗3遍，10 min/次，置于DMEM培养基（含2 mg/ml胶原酶Ⅳ）中，4℃消化1.5 h，PBS终止消化后30 μm细胞筛网分离上皮细胞，1 000 r/min离心5 min收集上皮细胞，用加有抗生素的BEGM培养液重悬细胞，细胞悬液移入塑料培养皿中37℃孵育1 h，用贴壁法移除成纤维细胞，收获的NEC转入细胞培养瓶，加入培养基培养，置于37℃、5% CO2培养箱中常规培养，每2～3 d换液1次。

1.3.2 细胞存活率检测 采用CCK-8法。将NEC接种到96孔板中（1 500个细胞/孔），待细胞贴壁后，吸弃培养基，加入含有不同浓度烟碱（10、20、40和80 μg/ml）的培养基培养，未添加烟碱的96孔细胞培养板为对照组，分别培养3、5 d后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，在37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h。以未添加烟碱的单纯培养基为空白组，采用酶标仪测定波长450 nm处吸光度（A）值，细胞存活率=[（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）]×100%。

1.3.3 NEC细胞因子IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2、GMCSF表达水平检测 采用ELISA法。NEC在含有不同浓度烟碱（10、20、40和80 μg/ml）的培养基中培养1、3、5 d后收集上清液。按试剂盒说明书操作步骤检测上清液中IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2、GM-CSF表达水平。

1.3.4 NEC表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）和蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）蛋白表达水平检测 采用Western blot法。将NEC接种至6孔板中，按上述干预方法加入烟碱进行干预，干预结束后，弃细胞上清液，PBS清洗2遍，每孔中加入100 μl RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白。BCA蛋白定量法确定并调整蛋白浓度，20 μg蛋白在SDS-PAGE中电泳，通过湿转法，将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉+TBST配置封闭液，室温封闭1 h后，加入anti-EGFR、anti-Akt抗体4℃孵育过夜，管家蛋白GAPDH为内参蛋白。第2天，TBST清洗PVDF膜3次后，加入HRP标记的抗兔抗体，室温孵育1 h，TBST再次清洗3遍后，ECL发光液显色，并以胶片曝光保存。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烟碱对NEC存活率的影响 与对照组比较，细胞培养3 d烟碱浓度为40和80 μg/ml的细胞活性均明显下降，细胞培养5 d烟碱浓度为10、20、40和80 μg/ml的细胞存活率均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与细胞培养3 d比较，细胞培养5 d烟碱浓度为40和80 μg/ml的细胞存活率均明显下降（均P＜0.05），见图1。

图1 不同浓度烟碱对NEC存活率的影响

2.2 烟碱对NEC细胞因子表达的影响 随着烟碱刺激时间及浓度上升，IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2及GMCSF表达水平总体呈上升趋势，但烟碱刺激5 d时烟碱浓度为80 μg/ml的NEC IL-3、eotaxin-2和GM-CSF表达水平均下降，见图2。

图2 烟碱对NEC细胞因子表达的影响（a：烟碱对NEC内IL-3表达的影响；b：烟碱对NEC内IL-5表达的影响；c：烟碱对NEC内IL-8表达的影响；d：烟碱对NEC内eotaxin-2表达的影响；e：烟碱对NEC内GM-CSF表达的影响）

2.3 烟碱对NEC EGFR和Akt蛋白表达水平的影响两种浓度烟碱刺激的NEC随着烟碱刺激时间的增加，Akt蛋白表达水平均呈明显上升趋势，其中烟碱刺激5 d时烟碱浓度为80 μg/ml的NEC较40 μg/ml的NEC升高更为明显；而烟碱在较高浓度及较长刺激时间等条件下才能上调EGFR蛋白表达水平，见图3。

图3 烟碱对NEC EGFR和Akt蛋白表达水平的影响（a：烟碱影响ECFR、Akt表达的电泳图；b：烟碱对Akt蛋白表达水平的影响；c：烟碱对EGFR蛋白表达水平的影响）

3 讨论

CRS是一种高度异质性慢性疾病，已成为一个重要的社会健康问题[7]。ECRS的病理特征是鼻腔鼻窦黏膜内大量嗜酸粒细胞集聚，是临床鼻科学最具挑战性和难治性的疾病之一。研究发现组织内嗜酸粒细胞增多不仅是ECRS的标志，也是疾病复发的重要危险因素[8]。多种上皮细胞来源的炎症细胞因子参与嗜酸性气道炎症的过程，2型细胞因子介导的炎症反应可以刺激嗜酸粒细胞聚集，导致ECRS的发生、发展[9]。驱动先天性2型炎症的上皮源性炎症细胞因子已经被充分研究，如IL-5是一种众所周知的2型细胞因子，对嗜酸粒细胞集聚和活化具有重要作用[10]。IL-3和GM-CSF在促进2型炎症反应中也具有至关重要的作用[11]，持续IL-3刺激可诱导嗜酸粒细胞脱颗粒作用，是局部炎性反应中可激活嗜酸粒细胞的最强的效应分子[12]。IL-8对淋巴细胞和嗜碱细胞也具有趋化作用，可以加重局部的炎性反应，可以增加嗜酸粒细胞的跨基底膜迁移，促进鼻息肉发病过程[13]。

既往研究发现烟碱与嗜酸粒细胞性炎症或变应反应性炎症无相关性[14]，但笔者前期研究结果表明ECRS和烟碱之间存在正相关性[5-6]，说明烟碱在ECRS发病机制中是具有促进作用的，但潜在病理机制仍不明确。Van Hove等[15]研究发现烟碱可通过树突状细胞相关途径加重变应性炎症。同时，也有研究表明慢性吸烟暴露可加重气道嗜酸粒细胞性炎症，促进气道黏膜重塑，其机制可能与IL-5、IL-1RA、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、缺氧诱导因子-1α表达上调有关[16]。

变应性鼻炎和CRS的鼻黏膜中EGFR表达量均显著增加[17]，且激活EGFR/Akt信号通路可诱导气道上皮细胞分泌黏液和炎性细胞因子GM-CSF、eotaxin和VEGF等，在气道嗜酸粒细胞性炎症中起重要作用[18]。为了确定烟碱刺激是否对NEC产生毒性反应，以了解烟碱对鼻窦黏膜中的作用，本研究选择不同浓度的烟碱，在培养条件下模拟吸烟者吸烟时NEC接触到的烟碱水平。结果表明，烟碱能够随着刺激时间和浓度的增加显著上调细胞因子 IL-5、IL-3、IL-8、eotaxin-2、GM-CSF及Akt等的表达量，且NEC活性降低，但是IL-3、eotaxin-2和GM-CSF在第5天的表达水平下降，这或许是因为烟碱随着刺激时间及浓度升高明显降低了NEC活性所致。另发现烟碱在较高浓度及较长刺激时间等条件下才能显著上调EGFR的表达，这说明烟碱在调控EGFR/Akt信号通路之外或许还有其他通路促进2型细胞因子的表达。

综上所述，烟碱或许通过调控EGFR/Akt信号通路上调IL-3、IL-5、IL-8、eotaxin-2、GM-CSF等细胞因子的表达，致鼻黏膜内嗜酸粒细胞募集，促进嗜酸粒细胞性炎症反应的发生、发展。本研究结果初步阐明了烟碱在ECRS发病机制中的生物学作用，也可以解释为什么吸烟者比非吸烟者的CRS术后复发率更高[19]。因此，戒烟应该是有助于降低ECRS的术后复发率。但是，NEC作为鼻黏膜免疫屏障层，是对吸入性污染物、刺激物和毒素的第一道防御。黏膜免疫屏障功能主要由连接上皮细胞的细胞间连接的完整性决定[20]，烟碱是否可破坏鼻黏膜免疫屏障功能，加重鼻黏膜嗜酸粒细胞性炎症的机制需要进一步的研究。