一测多评法同时测定不同产地佛手中6种化学成分的含量

曹士政，赵登高，马燕燕，张焜（五邑大学，广东 江门 529020）

佛手（Citrus medicaL. var.sarcodactylisSwingle）为芸香科香橼属植物佛手的果实，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的功效，可用于肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等症状[1]。佛手在中国长江以南多地有栽种，主要分为川佛手、广佛手和金佛手，其质量存在差异。《中国药典》2020年版采用单一的橙皮苷作为佛手的质量评价指标，难以对佛手的整体质量进行全面控制与准确评价。研究表明，除橙皮苷外，可增加6，7-二甲氧基香豆素、香叶木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯和水合氧化前胡素等5 个成分作为佛手的质量评价指标[2-4]。

一测多评（QAMS）法通过建立各个组分与内参物之间的相对校正因子，可实现多组分的一测多评[5]。QAMS 法不仅可以同时检测多指标成分，还能降低实验成本和检测周期[6]。目前佛手中化学成分的含量测定大多采用外标法[7-11]，实验操作过程烦琐，所需对照品价格昂贵。因此，本研究基于超高效液相色谱（UPLC）技术，建立了QAMS 法，测定佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素和佛手柑内酯的含量，为提升佛手的质量控制标准提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相系统（美国Waters 公司），KQ-500VDB 型超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司），SQP 电子天平（赛多利斯公司）。

1.2 试药

佛手药材于2021年购入，共15 批，由五邑大学生物科技与大健康学院马燕燕教授鉴定为芸香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的干燥果实，详细信息见表1；6，7-二甲氧基香豆素（批号：PS020517）、橙皮苷（批号：PS011588）、香叶木苷（批号：PS020083）、水合氧化前胡素（批号：PS001249）、5，7-二甲氧基香豆素（批号：PS021023）、佛手柑内酯（批号：PS002115）（对照品，纯度≥98%，成都普思生物科技有限公司）；甲醇（色谱级，默克），乙腈（色谱级，赛默飞世尔），水为超纯水。

表1 样品信息Tab 1 Source information of the samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）， 流速0.4 mL·min-1，进样量2 μL，柱温40℃，检测波长为330 nm，流动相：乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～2 min，10%A；2 ～12 min，10% ～15%A；12 ～17 min，15%A；17 ～17.5 min，15% ～17.2%A；17.5 ～33 min，17.2% ～25%A；33 ～53 min，25% ～75%A；53 ～54 min，75%～95%A；54 ～58 min，95%A；58～59 min，95%～10%A，59～62 min，10% A）。混合对照品与待测样品的色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）及待测样品（B）色谱图Fig 1 Chromatogram of mixed reference substance（A）and sample（B）

2.2 对照品溶液的制备

取对照品6，7-二甲氧基香豆素 1.01 mg，橙皮苷1.06 mg，香叶木苷 1.04 mg，水合氧化前胡素1.03 mg，5，7-二甲氧基香豆素 1.09 mg，佛手柑内酯 1.03 mg，分别用甲醇均配成1 mg·mL-1的对照品溶液。吸取各对照品溶液适量用甲醇稀释，制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 µg·mL-1梯度浓度的系列线性溶液，4℃冷藏静置备用。

2.3 供试品溶液制备

在25 mL 量瓶中加入佛手果粉末2 g，加入25 mL 甲醇后35 ℃超声（功率500 W，频率45 kHz）45 min，冷却后定容。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察 将“2.2”项下制备的对照品梯度系列线性溶液，按照“2.1”项下色谱条件依次进样，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各对照品的回归方程，信噪比S/N＝10 时求定量限，信噪比S/N＝3 时求检测限，结果表明，各化合物在相应质量浓度范围内与峰面积线性关系良好，结果见表2。

表2 佛手中6 种成分线性方程、线性范围、检测限和定量限Tab 2 Linear equation，linearity，detection limit and quantification limit of 6 components in Citrus medica

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2 μL，连续测定6 次，计算得各样品的日间和日内峰面积RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24、48 h 进样测定。6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯峰面积的RSD分别为0.69%、0.70%、1.9%、0.62%、0.40%、1.0%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

2.4.4 重复性试验 按照“2.3”项下方法制备佛手供试品溶液6 份，进样测定，结果6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯峰面积的RSD分别为2.0%、2.7%、2.3%、2.9%、1.3%、2.7%，表明样品重复性良好。

2.4.5 加样回收试验 称量佛手样品6 份，加入含量相同的对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，求得6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯的平均加样回收率（n＝6）分别为104.22%、105.36%、100.58%、102.18%、114.85%、100.06%，RSD分别为2.2%、2.1%、2.6%、2.2%、2.7%、0.38%，表明该方法回收率良好。

2.5 相对校正因子fs/i 的建立

本试验采用多点矫正法。根据fs/i＝fs/fi＝As×Ci/（Ai×Cs）计算QAMS 的fs/i，式中fs/i为内标物对待测组分i的校正因子，As为内标物峰面积，Cs为内标物浓度，Ai为待测组分i峰面积，Ci为待测组分i浓度。以5，7-二甲氧基香豆素为内参物，根据公式分别计算6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、佛手柑内酯的fs/i。

2.6 fs/i 耐用性评价

2.6.1 不同高效液相色谱仪和色谱柱对fs/i的影响分别考察了Waters ACQUITY UPLC H-Class、Aglient 1290 UPLC 两种高效液相色谱仪和Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Shim pack GLSS C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Supelco Titan C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）三种色谱柱对fs/i的影响，结果显示6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、佛手柑内酯在不同高效液相色谱仪和不同色谱柱上的fs/i的RSD分别为1.0%、2.5%、2.8%、2.6%、1.4%，均小于3%，单因素ANOVA检验显示差异无统计学意义，说明不同高效液相色谱仪和不同色谱柱对各成分的fs/i无明显影响。

2.6.2 不同进样体积对fs/i的影响 分别精密吸取不同体积（0.6、1、1.3、1.6、2 μL）的混合对照品溶液，依次注入高效液相色谱仪中进行检测，记录色谱峰峰面积，考察不同进样体积对fs/i的影响，结果表明，进样体积的改变对佛手各成分fs/i无明显影响，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯fs/i的RSD依次为1.2%、1.4%、1.4%、2.0%、0.94%，均小于2.5%，单因素ANOVA 检验显示差异无统计学意义，说明不同进样体积对各成分的fs/i无明显影响。

2.6.3 不同色谱柱柱温对fs/i的影响 采用Waters ACQUITY UPLC H-Class，Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），分别使用不同柱温（25、30、35、40、45 ℃）对混合对照品溶液进行检测，结果表明，柱温的改变对佛手6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯fs/i无明显影响，各成分fs/i的RSD依次为1.5%、1.7%、2.4%、1.5%、1.0%，均小于2.5%，单因素ANOVA 检验显示差异无统计学意义，说明不同色谱柱柱温对各成分的fs/i无明显影响。

2.6.4 不同流速对fs/i的影响 分别使用不同流速（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL·min-1）对混合对照品溶液进行检测，记录色谱峰峰面积，考察不同流速对fs/i的影响。结果表明，流速的改变对佛手各个成分fs/i无明显影响，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯fs/i的RSD依次为1.8%、2.2%、1.0%、1.9%、1.9%，均小于2.5%，单因素ANOVA 检验显示差异无统计学意义，说明不同流速对各成分的fs/i无明显影响。

2.6.5 不同检测波长对fs/i的影响 分别使用不同波长（328、329、330、331、332 nm）对混合对照品溶液进行检测，记录色谱峰峰面积，考察不同检测波长对fs/i的影响。结果表明，检测波长的改变对佛手各个成分fs/i无明显影响，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯fs/i的RSD依次为2.8%、1.7%、2.7%、2.6%、2.7%，均小于3%，单因素ANOVA 检验显示差异无统计学意义，说明不同检测波长对各成分的fs/i无明显影响。

2.6.6 不同操作人员对fs/i的影响 不同操作人员按照“2.2”项下方法制备对照品，在“2.1”项色谱条件下，分别对混合对照品溶液进行检测，记录色谱峰峰面积，考察不同操作人员对fs/i的影响。结果表明，操作人员的改变对佛手各个成分fs/i无明显影响，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯fs/i的RSD依次为2.2%、1.1%、2.6%、0.85%、1.9%，均小于3%，单因素ANOVA 检验显示差异无统计学意义，说明不同操作人员对各成分的fs/i无明显影响。

2.7 待测成分的色谱峰定位

通过计算在不同色谱仪和不同色谱柱中，佛手各组分的色谱峰与5，7-二甲氧基香豆素色谱峰的相对保留时间（ts/i），对各待测组分进行定位，结果不同仪器与色谱柱测得的ts/i的RSD均小于2.5%，表明可以以ts/i对佛手中各组分的色谱峰进行定位。

2.8 QAMS 与外标法测定结果的比较

取15 批佛手药材粉末制成样品溶液，精密吸取2 µL 注入液相色谱仪进行测定。分别采用QAMS 法和外标法计算15 批佛手中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑内酯的含量，每批3 份，结果见表3。将QAMS 法与外标法测得的各组分含量进行比较，发现两种方法测得的6 种组分含量基本一致，RSD均小于3%。单因素ANOVA 检验分析结果表明，QAMS 法与外标法所得结果差异无统计学意义，说明该QAMS 法可以替代外标法用于佛手药材的含量测定。

表3 QAMS 法与外标法测得15 批佛手中6 种成分的含量(mg·g-1，n ＝3)Tab 3 Contents of 6 components in 15 batches of Citrus medica measured by QAMS method and ESM (mg·g-1，n ＝3)

2.9 指纹图谱建立及相似度评价

为了解这15 批来源不同的佛手药材的差异，本研究进行了指纹图谱的考察。将15 批佛手药材按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，将15 批样品指纹图谱的CDF 数据文件导入中药指纹图谱相似度评价系统（2004 版），进行相似度计算，设置样品S12图谱为参照图谱，根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范2004A，采用中位数法产生对照指纹图谱，时间窗宽度为0.1，由19 个峰校正，自动匹配，生成对照指纹图谱（见图2），其相似度结果见表4。15 批佛手的相似度均大于0.94，这表明不同产地的佛手药材具有较高的一致性。四川安岳与广西桂林的相似度较差，可能与药材的质量有关。

表4 不同产地佛手的相似度Tab 4 Similarity of Citrus medica from different regious

图2 15批佛手的UPLC 指纹图谱Fig 2 UPLC fingerprints of 15 batches of Citrus medica

2.10 聚类分析

以不同产地佛手样品的19 个峰含量为变量，采用SPSS 22.0 统计软件对15 批佛手药材进行聚类分析，结果见图3。采用组间联接的聚类方法，选取欧式距离平方和作为样本测度。当欧式距离平方和为15 时，佛手药材可以分为3 类，Ⅰ类为S1，S11，S12，S14，S3，S9，S13；Ⅱ类为S2，S7；Ⅲ类为S4，S10，S6，S5，S8，S15。上述结果与相似度评价一致，相同产地不同批次样品间差异较小，浙江金华与广东的佛手比较相似，四川、云南、广西、重庆的佛手比较相似。推测影响分类的结果可能与药材产地的纬度、气候及土壤等有一定联系。

图3 15批佛手指纹图谱聚类分析Fig 3 Cluster analysis of fingerprints of 15 batches of Citrus medica

3 讨论

与HPLC 法相比，UPLC 法具有灵敏度高、线性范围宽、分析时间短等优点，本试验的线性范围达到了0.05 ～100 μg·mL-1，定量限和检测限分别达到了0.05 和0.025 μg·mL-1，表明本方法具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。本试验对样品进行了190 ～400 nm 全波长扫描，比较各波长下色谱图，各成分在330 nm 处均有较大吸收。因此本试验选用330 nm 为检测波长。

钟艳梅等[4]研究显示，香豆素类成分的含量差异是区分佛手药材的关键指标。佛手中的香豆素类成分具有多种生物活性，水合氧化前胡素具有抗炎、抗肿瘤等活性、6，7-二甲氧基香豆素具有止喘及降血压作用[12]，佛手柑内酯具有催眠抗肿瘤等活性[14]。因此，本试验在橙皮苷的基础上，增加水合氧化前胡素等香豆素类化合物作为指标，建立更全面、快速、高效的多组分含量测定方法。

佛手在我国南方多地均有栽培，根据产地的不同，佛手可分为川佛手、广佛手、金佛手。本研究聚类分析表明，东南地区的广东佛手和浙江佛手聚为一类，西南地区的四川、云南和广西佛手聚为一类。说明不同地域的佛手虽有差异，但亦有相同之处。

综上所述，本试验采用UPLC 技术建立了以5，7-二甲氧基香豆素为内参物的QAMS 法，用于测定佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香叶木苷、水合氧化前胡素和佛手柑内酯等6 种化学成分的含量，该方法操作简便，精密度高，稳定性、重复性好，为全面评价不同产地佛手的质量提供了参考根据。