小檗碱在牙周炎治疗中的研究进展

黄 慧，曹丰弟，张 晔*

0 引言

牙周炎(Periodontitis)，即发生在牙周支持组织的慢性炎症，牙菌斑作为始动因子，其发生、发展、转归决定于病原微生物与机体免疫机能的平衡。牙周支持组织的进行性、不可逆性破坏是其主要特征，在未经治疗的情况下，牙周膜的崩解和牙槽骨的吸收最终导致牙齿松动甚至脱落。由牙周致病菌分泌的炎症因子与牙周炎症的进展密切相关[1]。目前，针对牙周炎的治疗方法主要为洁治、刮治等基础治疗后辅以药物治疗(包括抗菌类、非甾体抗炎类、含漱类药物和维生素类药物)，但牙周炎作为慢性炎症过程，长期使用药物会导致口腔菌群紊乱、耐药性增加等，给治疗带来难度。小檗碱(Berberine，BBR)，又名黄连素，是黄连中最具代表性且含量最高的一类天然的苄基异喹啉类生物碱[2]，目前其已被证实为一种无细胞毒性、无致突变作用且用途广泛的药物[3]。小檗碱能凭借多途径、多靶点及多效应的优势，发挥降糖[4]、降脂[5]、促成骨[6]、调菌群[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、神经保护[10]和抗抑郁[11]等多种药理活性。在牙周炎治疗中，多种用于牙周炎的中药复方制剂中都含有小檗碱，如金栀洁龈含漱液、唇齿清胃丸和黄连解毒汤加味[12]。此外，含有大量小檗碱的药膜放入牙周袋后可显著降低牙周炎的严重程度，提高牙周洁治、刮治后的疗效[13-14]。小檗碱作用于牙周炎的机制是通过调控多种信号通路发挥抗菌、抗炎和调节骨代谢的药效，其中重要的有NF-κB、p38MAPK和AMPK等信号通路，本文将从这3个主要药理作用介绍小檗碱在牙周炎治疗中的机制。

1 抗菌

小檗碱抗菌谱广，能对大多数牙周致病菌发挥抑制效果。Hu等[15]研究表明，小檗碱在最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)时即对大部分牙周致病菌如伴放线菌(MIC=13 μg/ml)和牙龈卟啉单胞菌(MIC=20 μg/ml)具有显著抑制活性，而高于MIC时则能杀菌。进一步研究揭示小檗碱能在不干扰正常口腔菌群的情况下，较强抑制伴放线杆菌、牙龈卟啉菌的生长，并且抑制伴放线杆菌的能力强于牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)，提示小檗碱有望用于各型牙周炎的治疗，尤其是青少年牙周炎[16-17]。

小檗碱主要通过抑制菌体活性、降低离子泵活性、破坏菌体结构、作用于菌体酶影响菌体的复制和转录以及阻止细胞内蛋白质等多种作用机制发挥抗菌活性。众多研究指出，小檗碱作用于细菌后可降低胞膜上钠钾泵的活力，破坏细菌的细胞膜结构，抑制细菌的胶原酶活性，完全破坏蛋白质或部分降解蛋白质，以及通过影响DNA拓扑异构酶的活性来抑制DNA的合成或抑制RNA转录，破坏生物膜中蛋白质的结合，从而中断其稳定性，最终导致细菌死亡[15,18-20]。最近的研究对小檗碱的抗菌活性做了新的解释，打破了先前报道的小檗碱直接杀菌作用，提出小檗碱是通过增强宿主防御细胞如巨噬细胞/中性粒细胞对微生物感染的能力来间接发挥抗菌活性，该体内外实验证明小檗碱可增强ATP诱导的炎症小体蛋白3(NOD-like receptor protein，NLRP)的激活以及白细胞介素(Interleukin，IL)-1β的释放，加强宿主对细菌感染的防御，该过程涉及AMPK信号传导通路，但是小檗碱介导的AMPK信号传导与炎症小体间的相互作用机制还需进一步阐明[21]。可见，小檗碱发挥抗菌作用值得肯定，但研究限于体内外动物实验，有待于临床实验验证。

小檗碱联合其他药物或材料同样能发挥良好的抗菌作用，可作为一种新型抗菌工具为牙周炎的治疗提供重要临床参考价值，有望成为控制口腔微生物群的有前途的药物。当小檗碱与奥硝唑、四环素或多西环素等联合使用时，可对口腔中病原体的生长发挥协同抑制作用，有利于控制牙周细菌，这为小檗碱有望作为口腔常规治疗药物提供了合理的理论基础[22-23]。柳玉梅等[24]研制出了具备良好温敏性能的小檗碱/壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶，将小檗碱负载于水凝胶支架上，其缓释的小檗碱对牙龈卟啉单胞菌具有抑制作用。可见小檗碱联合支架材料能协同发挥良好的抗菌效能，为该单体的抗菌效能释放提供了新方向。

2 抗炎

2.1 小檗碱与炎症因子 小檗碱可通过抑制多种炎症因子的合成及释放控制炎症的发生发展。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-1β、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)和环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)等促炎物质与牙周炎的发生发展密切相关，其含量的升高能使炎性细胞浸润和血管舒张，加重牙周局部炎症肿胀以及损伤程度，而小檗碱可抑制以上促炎因子的水平，减弱炎症细胞浸润和牙周组织水肿程度[25-27]。Jia等[28]建立了去卵巢(Ovariectomized，OVX)大鼠的实验性牙周炎，分别应用载体与小檗碱治疗7周后发现，小檗碱治疗的OVX-牙周炎大鼠中的IL-17A相关免疫反应、血清中促炎细胞因子水平显著低于载体治疗组，牙周组织炎症得到缓解以及牙槽骨吸收得到抑制。Tu等[29]在体内外研究了小檗碱对基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)的作用效果，表明小檗碱能抑制MMP活性进而逆转脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)对牙周组织细胞的抑制作用，进而减轻由丝线结扎所诱导的牙周炎大鼠的牙周破坏情况，这为小檗碱预防炎症期间牙周组织降解提供了理论依据，但小檗碱抑制MMP的作用机制有待进一步研究。

2.2 小檗碱抗炎机制 小檗碱的抗炎机制涉及多种信号通路，如p38MAPK、NF-κB、AMPK和AKT等信号通路。其中，最重要的信号通路是p38MAPK和NF-κB通路。

2.2.1 p38MAPK、NF-κB通路 p38MAPK/NF-κB信号通路是机体内重要的炎症信号途径，多项研究已证实炎症介质能激活p38MAPK/NF-κB信号通路[30]。小檗碱能通过下调该信号通路进而逆转牙周组织炎症反应。正常状态下，NF-κB与其抑制分子I-κBα的结合位于胞质中，而在炎症等激活过程中，I-κBα被磷酸化和降解后与NF-κB分离，分离后活化的NF-κB是由p50亚单位和p65亚单位组成的异源二聚体，可以进入细胞核，并与包括iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6在内的促炎基因的启动子结合，引起炎症介质基因的转录和表达[31]。Park等[32]研究利用LPS诱导巨噬细胞中的I-κBα磷酸化和NF-κB的核易位后，采用小檗碱结合天竺葵(Pelargonium sidoides，PS)来处理该细胞，发现经该组合物处理后，I-κBα的表达显著降低，表明其显著阻断了LPS对NF-κB信号通路的激活，证明了该药物是通过调节NF-κB信号通路来发挥抗炎作用的，这一结果间接表明了含小檗碱的方剂可能是治疗各种炎症性疾病的潜在候选药物，也有助于更好地理解炎症反应调控的分子机制。Gu等[25]的研究利用结扎诱导牙周炎大鼠模型观察小檗碱对牙槽骨丢失、牙周组织学变化和炎性细胞因子水平变化的影响，与结扎+盐水组相比，结扎+小檗碱组大鼠的炎症细胞浸润以及水肿程度明显减轻，而G蛋白偶联受体30(G-protein-coupled receptor，GPR30，也称为G蛋白偶联雌激素受体)表达显著增加，p38MAPK和NF-κB水平降低，其机制可能为GPR30是p38MAPK/NF-κB通路的关键调节剂，小檗碱可以促进牙周炎大鼠模型中GPR30诱导的p38MAPK/NF-κB通路失活，进而预防牙周炎的牙槽骨丢失和炎症。

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)家族是介导炎症反应的关键受体蛋白，它可以识别牙周病原体并激活下游信号，增加p38MAPK的磷酸化，导致NF-κB和c-JunN末端激酶(c-JunN terminal kinase，JNK)的激活、炎症细胞因子增加，最终加剧炎症反应[33-34]。TLR4作为一种I型跨膜蛋白，其细胞外片段能识别LPS，而细胞内片段参与信号转导。在其表面具有多个位点与小檗碱结合，利用这一特性有助于探究BBR的抗炎机制。经LPS极化后的M1巨噬细胞产生促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α等，其细胞形态改变也逐渐发生变化，NF-κB p65的核分布增加[35]，而小檗碱能抑制M1巨噬细胞的极化，与TLR4相互作用并干扰TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路以及TLR4/JNK/NF-κB信号通路[36-37]。TLR2可通过增强NF-κB的活化介导细菌及其产物对组织细胞的激活和损伤，小檗碱能通过下调TLR2/NF-κB信号通路分子的表达，进而降低炎性因子水平[38]。因此，通过小檗碱来抑制M1巨噬细胞的极化进而调控NF-κB相关信号通路有望成为预防和治疗牙周炎症的有前景的策略。

2.2.2 其他信号通路 小檗碱通过激活巨噬细胞中的AMPK通路进而抑制炎症反应，其机制为AMPK被小檗碱激活后，抑制了MAPK的磷酸化以及巨噬细胞中活性氧的水平，抑制巨噬细胞的促炎反应，反之，当AMPK活性受到抑制后，小檗碱对促炎基因的表达和促炎信号通路的抑制作用消失[39]。这一双向验证为小檗碱可作用于AMPK通路而发挥抗炎作用奠定了有利的理论基础。此外，小檗碱还可以上调Akt，下调STAT6、Wnt/β-catenin和Hedgehog等信号途径，在全身不同部位发挥对炎症组织损伤的保护作用[40-42]。

3 骨代谢

目前，临床上使用的抗骨吸收药物如双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂或降钙素等，其主要是通过抑制破骨细胞的活性来减少骨质流失，但是这些药物存在的最大局限性是缺乏骨结构修复。而小檗碱不仅能抑制骨骼分解，还具有刺激新骨形成以恢复骨密度和强度的特点。小檗碱的这一独特优势在治疗牙周炎所致的牙槽骨破坏中具有重要意义。

3.1 小檗碱抑制骨吸收 小檗碱可抑制NF-κB、活化T细胞的核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFATc)、RANKL/RANK/OPG、AMPK和Akt等信号通路，降低破骨细胞的数量及生物活性，其中最重要的通路是NF-κB、RANKL/RANK/OPG信号通路。在这些通路中，小檗碱发挥核心作用的机制主要是围绕于调节破骨细胞的形成和活性，在各个抑制骨吸收的通路中，其主要依靠阻断破骨细胞的形成或调节成骨细胞能力达到成骨与破骨细胞间的动态平衡，从而预防骨组织流失，维持骨量。

在破骨细胞系中的NF-κB、NFAT及Akt对小檗碱高度敏感，小檗碱可以抑制这些信号途径，减少破骨细胞的形成和存活[43]。破骨细胞是源自造血干细胞的单核细胞/巨噬细胞谱系的多核巨细胞，RANKL通过作用破骨细胞前体使其分化为成熟的破骨细胞[44]。RANKL-RANK相互作用能激活一系列细胞内信号传导途径，包括NF-κB、PI3K/AKT、NFATc1和MAPKs。NFATc1是RANKL介导的关键转录因子，其能诱导多种破骨细胞相关基因的转录，例如NFATc1能与破骨细胞特异性基因启动子上的c-Fos发挥协同作用，促进破骨细胞的生成，但NFATc1还能作用于其自身的基因，放大NFATc1介导的转录程序[45]。Zhou等[43]研究证明，在不影响BMMs生存能力的同时，浓度为0.25 μM、0.5 μM和1 μM的硫酸小檗碱能显著抑制破骨细胞的形成，其机制为小檗碱能抑制破骨细胞标记基因-NFATc1、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAcP)和液泡型H+-ATPase V0亚基D2(Vacuolar-type H+-ATPase V0 subunit D2，V-ATPase d2)等的表达，进而抑制了RANKL诱导的NF-κB和NFAT活性受体发挥作用。Hu等[46]证明了低至0.2 μM的小檗碱能显著抑制RANKL，进而抑制NF-κB和Akt的激活，阻断破骨细胞生成和存活。因此，小檗碱能抑制RANKL介导的信号分子从而减少破骨细胞形成这一重要药理活性，能为治疗和预防牙周炎所致的牙槽骨吸收创造潜在突破口。

此外，氧化应激可以抑制成骨细胞的分化而刺激破骨细胞的分化。OPG/RANKL途径是破骨细胞分化的重要信号转导途径，而氧化应激会激活RANKL/RANK相互作用，同时会抑制OPG/RANKL/RANK通路，进而导致骨质疏松[47]。而小檗碱具有抗氧化作用，能通过激活OPG/RANKL/RANK通路增加骨钙素水平，抑制破骨细胞中的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，NOX1)产生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，进一步抑制破骨细胞前体细胞的分化，一定程度上减少了大鼠骨质疏松的发展[48]。同时，AMPK通路在调节Runx2和RANKL/OPG的骨骼生理中也起着至关重要的作用。利用小檗碱治疗骨质疏松的实验取得了肯定的结果，小檗碱可通过激活AMPK途径来增加Runx2，骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)和骨钙蛋白(Osteocalcin，OCN)含量，降低RANKL水平，调节成骨作用，缓解骨质疏松[49]。考虑到破骨细胞在骨重塑中的重要作用，通过对破骨细胞形成机制入手，研究小檗碱对破骨细胞的影响，不失为一种新型治疗骨流失的治疗方法。

3.2 小檗碱促进骨形成 小檗碱促成骨作用同样涉及多种信号转导途径，如Wnt/β-catenin、p38MAPK、ERK和蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)等途径。其中，Wnt/β-catenin、p38MAPK、ERK信号途径不仅对于研究小檗碱的抗炎药效具有重要作用，对于研究成骨分化机制也具有研究价值。

3.2.1 Wnt/β-catenin、p38MAPK信号通路 Wnt/β-catenin信号途径在骨代谢研究中具有重大价值。Wnts通过调节细胞的增殖、分化和凋亡来介导细胞的生理活动。当经典Wnt/β-catenin信号通路被激活时，糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)被抑制，β-catenin积累并转移至细胞核，与转录因子Lef/Tcf结合，导致Wnt下游靶基因的转录[50]。Wnt信号可通过激活p38MAPK通路增强牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的成骨分化，同时，Wnt/β-catenin信号通路可间接降低破骨细胞的分化，增加成骨分化基因的表达，进而提高骨量[51-52]。基于此，许多学者着眼于成骨机制，研究了小檗碱在该通路中的成骨效果。在牙周炎症微环境中，PDLSCs和骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)等间充质细胞的成骨分化特性受到抑制，而小檗碱可以恢复干细胞成骨分化过程中的p38MAPK通路，激活经典Wnt信号转导，上调β-catenin、成骨分化标记基因，促进间充质细胞向成骨细胞分化，而形成的成骨细胞能进一步导致Wnt/β-catenin通路正反馈激活，造成骨组织的增加[53-55]。相反，在糖尿病患者牙周炎组织中，晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)可通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路减弱人牙周膜干细胞(Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)的成骨潜能，而小檗碱能通过抑制该途径减弱这些作用，增强炎症微环境中hPDLSCs的成骨分化能力[56]。可见，小檗碱不管在何种炎症环境中都能发挥正向骨调节优势。

3.2.2 其他信号通路 ERK信号通路在研究小檗碱的抗炎、促成骨机制中均发挥重要作用。有研究筛选出表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor，EGFR)是小檗碱与hPDLSCs膜之间的靶位点，小檗碱与EGFR结合后，可激活胞内ERK信号途径；小檗碱还通过增加PKA信号通路的激活来稳定Runx2/Osterix，上调成骨标志物基因，增强成骨分化[6,57]。因此，在天然产物中所开发的新型促成骨药物小檗碱具有强大的促骨向分化能力，能通过调控以上多种信号途径，上调细胞内成骨标志物基因的表达，实现成骨分化，其有望成为治疗牙周病所致的牙槽骨病损的一个有前景的解决方案。

4 总结和展望

尽管许多研究已经明确了小檗碱具有抗菌、抗炎和促成骨分化的作用，但小檗碱在牙周炎治疗中的研究尚处于初期阶段。其药理作用尚未完全明确，需要对此进行深入、全面的研究。筛选出小檗碱发挥多种药效的共同靶点，为小檗碱治疗牙周炎提供新的临床见解，对牙周疾病的中医治疗具有重要理论及临床意义。