日粮中添加黄芪多糖对坏死性肠炎肉鸡Th17/Treg平衡和肠道菌群的影响

郭 懿

（濮阳职业技术学院，河南濮阳 457000）

坏死性肠炎（NE）是由A型或C型产气荚膜梭菌引起的肠毒性疾病。坏死性肠炎的死亡率很高，发生急性疾病时死亡率高达50%，尤其是发生在雏鸡阶段，而慢性坏死性肠炎会显著降低鸡的生长性能，引起肠溃疡、侵蚀等不利影响，严重影响家禽健康，给家禽养殖业造成严重的经济损失（Mcdevitt等，2006）。辅助 T细胞 17（Th17）是促进免疫反应的关键性T细胞类型，调节性T细胞（Treg）是与Th17细胞功能相反的一种免疫调节细胞。用coccidia攻击的鸡显著增加了脾脏和盲肠扁桃体中Th17细胞的比例（Kim等，2019）。Th17/Treg细胞已在患有溃疡性结肠炎的哺乳动物中得到广泛研究，但没有关于感染坏死性肠炎的肉鸡中报道过Th17细胞比例的变化。

黄芪多糖（APS）具有增强免疫和抗炎特性，可调节机体的免疫功能。研究发现，在日粮中添加4 mg/kg APS对受到脂多糖（LPS）攻击的肉鸡具有免疫调节作用，可以逆转LPS的负面影响，其包括每日体重增加，采食量减少，空肠上皮淋巴细胞数量和绒毛高度的减少（Wang等，2015）。但在家禽中关于APS对Th17/Treg平衡影响的研究十分有限。肠道健康的鸡不仅能提高饲料营养物质的消化吸收率，还能抵抗肠道病原菌的侵袭，减少因病死亡和并发症造成的经济损失，是保证鸡生长性能良好的关键因素（Ulluwishewa等，2011）。影响肠道健康的因素包括饮食、病原体、环境和管理。植物多糖可以逃避小肠的吸收，到达肠道后半部被微生物群发酵，通过微生物群依赖性发挥抗炎、免疫调节、肠道屏障保护、抗氧化等活性，因此成为研究热点（Liu等，2020）。在本研究中，我们探讨膳食APS补充剂是否可能调节坏死性肠炎肉鸡的细胞免疫和肠道菌群。

1 材料和方法

1.1 黄芪多糖本研究中使用的APS购自北京中心生物有限公司。APS是从黄芪中提取的。APS的纯度为80%。APS的分子量通过LC-MS测定，范围为8～160000道尔顿。根据北京中心生物有限公司推荐的最佳添加量，本研究中APS添加量为200 mg/kg。

1.2 试验动物和日粮使用2×2因子排列将240只AA肉鸡（1日龄）随机分为4组，分别是对照组（标准日粮）、黄芪多糖组（日粮添加200 mg/kg APS）、感染坏死性肠炎攻击组（标准日粮）、感染坏死性肠炎攻击组（日粮添加200 mg/kg APS）。每组各60只AA肉鸡。根据国家研究委员会（NRC 2012）的建议，应制定无药物的玉米-豆粕型日粮，以满足或超过肉鸡的营养需求。使用双层立体鸡舍，整个实验遵循标准管理程序。鸡可以自由获得干净的水和饲料。本试验为期31 d。

1.3 坏死性肠炎模型的建立第13日龄攻毒组肉鸡经口接种30倍剂量的球虫IV减毒疫苗（佛山生物科技有限公司，中国佛山）。对照组同时口服1mL无菌PBS。攻毒开始前提前8 h断料，连续攻毒7 d，攻毒组所有肉鸡经口接种1 mL新鲜制备的1×浓度的产气荚膜梭菌CVCC2030浓度为109CFU/mL（中国兽药控制中心，北京，中国）。对照组肉鸡在同一时间点强制饲喂等体积（1 mL）灭菌的巯基乙酸盐液体培养基（FT，CM801，北京路桥科技有限公司）。

1.4 样品采集和指标测定

1.4.1 生产性能 记录肉鸡13、25和31日龄的饲料用量和体重，计算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和饲料转化率（FCR）。

1.4.2 流式细胞检测血液中Th17细胞和Th17/Treg比例 采用翅膀内侧静脉采血。血液加入肝素抗凝血Th17细胞以CD4 PerCP-Cy5.5和RORγt PE-A标记，Treg 细胞以CD25 FITC-A和 FoxP3 APC-A标记。分别加入抗体室温避光孵育15 min，加入500μL Lysing Solution 轻轻混匀，室温避光孵育10 min，加入1.5 mL PBS 缓冲液，以2500 r/min离心10 min，弃上清后加入PBS缓冲液轻轻混匀，上流式细胞仪进行分析。

1.4.3 盲肠微生物计数 无菌条件下采集感染后2和8 d的肉鸡盲肠标本，液氮快速冷冻。具体方法如下：将盲肠置于冰上（约4℃）解冻，在洁净工作台上用天平称取0.3 g，置于5 mL无菌离心管中。然后将0.3 mL上清液移至无菌离心管中，用无菌生理盐水进行 102、103、104、105、106、107的梯度稀释，将来自每个稀释管的100μL溶液接种到相应的选择性培养基上，并将平板铺开直在溶液培养基上干燥。选择30～300个菌落进行细菌计数。

1.5 统计分析采用SPSS 20.0软件对各组数据进行统计分析。GLM过程用于统计分析。当交互作用显著时采用单因素分析，采用Duncan′s法进行多重比较。P＜0.05表示差异显著，0.05＜P＜0.10表示具有一定的趋势。

图2 日粮中添加黄芪多糖对坏死性肠炎肉鸡外周细胞免疫功能的影响

2 结果

2.1 对生长性能的影响由图1可知，在第13天和第25天，各组肉鸡体重无显著差异。与对照组相比，第31天时，APS添加组体重显著增加420 g（P ＜ 0.05）（图1A）。 在 13～ 15 d APS组体重变化显著增加50 g（P＜0.05）（图1B）。与对照组相比，在第25～31天，补充APS可以显著增加平均采食量42 g（图1C），此外，日粮添加APS减轻了NE对生长性能的负面影响，并且显著增加了13～25 g和25～31 d的饲料转化率（P ＜ 0.05）（图1D）。

图1 日粮添加黄芪多糖对坏死性肠炎肉鸡生长性能的影响

2.2 对外周细胞的免疫功能的影响分别在第25天和第31天检测Th17细胞、Treg细胞及Th17/Treg细胞比例。Treg细胞比例在第25天和第31天各组别无显著差异。与未受NE攻击的鸡相比，NE攻击的鸡在第25天时外周血中Th17细胞比例显著增加8%（P＜0.05），第25天Th17/Treg细胞比例显著增加0.39%（P＜0.05）。与对照组相比，日粮添加APS显著降低4%的第25天时外周血中Th17细胞比例（P＜0.05），在攻毒组中，日粮添加APS显著下调了25日龄Th17/Treg细胞比例（P＜0.05）。

2.3 盲肠微生物群检测用培养计数法检测盲肠中产气荚膜梭菌和乳酸杆菌的含量。结果表明，与未攻击的鸡相比，NE攻击的鸡在第31天盲肠中产气荚膜梭菌的数量显著增加1.2 CFU/g（P＜0.05），乳酸杆菌的数量没有显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，日粮添加APS显著降低了第31天盲肠中0.43 CFU/g的产气荚膜梭菌数量（P＜0.05），乳酸杆菌的数量无显著差异（P＞0.05）。

图3 产气荚膜梭菌和乳酸杆菌的数量用培养计数法检测盲肠中的含量

3 讨论

坏死性肠炎（NE）是一种由产气荚膜梭菌引起的肠毒性疾病[1]。该病多发生在2～5周龄的肉鸡身上，死亡率为2%～10%，最高可达50%。Geier等（2010）研究表明，坏死性肠炎可以增加肉鸡的料肉比、死亡率和肠道疾病，降低体重。生长性能下降的主要原因是球虫引起蛋白质（包括血浆）渗入肠腔，促进产毒梭菌的快速繁殖和致病性，导致小肠消化吸收能力下降。据估计，家禽业每年由于坏死性肠炎造成的损失高达20亿美元（Mcdevitt等，2006）。该实验观察到 NE感染对肉鸡体重增加有显著的负面影响（Song等，2017）。补充APS可有效改善NE感染引起的生长性能下降。APS提高了鸡的生长性能，对其他动物的生长有积极影响，如猪，APS缓解了NE引起的生长性能下降，这可能是由于APS的直接抑菌作用减少了产气荚膜梭菌，或调节了宿主免疫功能，达到杀菌和间接抑菌作用，从而减少肠道损伤和生长性能的损失。其次，研究发现NE感染增加了Th17细胞比率和Th17/Treg细胞比率。据报道，产肠毒素大肠杆菌攻击小鼠显著上调脾脏和肠黏膜淋巴结中Th17和Treg 细胞的比例，上调肠黏膜淋巴结中RORα的 mRNA和蛋白表达，下调mRNA和Foxp3的蛋白表达（Wang等，2017）。膳食补充APS可降低Th17/Treg细胞和Th17/IL-10细胞因子比例，缓解NE引起的全身炎症。APS主要通过降低TLR4和NF-κB等基因的转录来缓解LPS诱导的鸡的免疫应激反应（Liu等，2015）。我们推测这可能是由于APS可减轻肠道炎症，改善肠道屏障，从而间接缓解全身炎症。

4 结论

日粮添加APS减轻了NE对生长性能的负面影响，显著降低了肉鸡25日龄时血清中Th17细胞、Th17/Treg比例以及31日龄肉鸡盲肠中产气荚膜梭菌的数量。总之，APS 可能通过调节肠道免疫、Th17/Treg平衡及肠道微生物群来减轻受到NE攻击肉鸡的肠道炎症。