隐球菌荚膜体内生长机制研究进展

陈敏 潘炜华 廖万清

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所上海市医学真菌分子生物学重点实验室全军真菌病重点实验室中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室，上海 200003)

隐球菌 (CryptococcusneoformansandCryptococcus gattii)最常侵犯人类或哺乳动物的中枢神经系统，引起致命的隐球菌性脑膜脑炎(Cryptococcal meningitis)，已是目前临床上最重要的致病真菌之一［1］。近20 a来，生物医学很多领域都取得重要进展，而隐球菌病的发病率及病死率却没有下降，即使在医学发达国家隐球菌性脑膜脑炎3个月内死亡率亦达20%［2］;而艾滋病患者并发隐球菌病出现临床症状后，若不及时接受高效联合抗逆转录病毒 (highly active antiretroviral therapy，HARRT)及抗真菌治疗，2周内死亡率达100%［3］，这与其确切的致病机制还未揭示密切相关。荚膜是隐球菌最显著的形态学特征性结构，是其维持菌体内环境稳定、适应环境压力及抵御宿主免疫细胞吞噬的第一道屏障，也是隐球菌最重要的毒性因子［4］。近年来，隐球菌荚膜表型转化相关分子途径及其调节机制是国内外医学真菌学研究领域的前沿与热点［1，4-5］。本文现就隐球菌荚膜相关致病分子机制研究进展及其前沿性工作做一综述。

1 隐球菌荚膜主要结构组分

隐球菌荚膜的主要组分是葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)、半乳糖木糖甘露聚糖 (GalXM)和甘露糖蛋白(MP)，其中GXM是新生隐球菌荚膜中含量最多的多糖 (90% ～95%)，其次是GalXM(5% ～ 8%)及MP(1%)［4］。

作为隐球菌最重要的毒性因子，荚膜具有高度的亲水性［6］。GXM纵贯分布于整个多糖荚膜，是构成荚膜毒性因子的主要因素［4，7］。GXM 由一个 α-(1，3)-甘露聚糖主链结合β-(1，2)-葡萄糖醛酸残基和数量不定的6-○-乙酰基构成，其中甘露糖、葡萄糖醛酸及木糖是合成GXM的前体，不同比例的甘露糖、葡萄糖醛酸及木糖残基可构成不同亚型的GXM，由此根据免疫学方法将隐球菌划分为多种血清学分型［8］。然而，迄今为止利用GXM相关荧光抗体对隐球菌多糖荚膜的物理结构的研究却显示隐球菌多糖荚膜的结构是一种复杂的、多变的、人类还没有完全了解的多糖结构［9-10］。与GXM不同，GalXM在荚膜中的确切位置及功能目前还不明确［4］，但有研究显示半乳糖、甘露糖、半乳聚糖及呋喃半乳糖是合成GalXM的前体。GalXM的相对分子质量 (1.01×105)比GXM的相对分子质量 (1.7×106)小得多，但荚膜中的GalXM摩尔数含量比GXM要多［11］。MP是隐球菌荚膜组成中含量最少的组分，最早由人们利用13C-NMR(核磁共振碳谱)分析去除了GXM及GalXM的隐球菌培养上清液而发现［12］，对其相关研究甚少，仅有的研究结果认为其位于荚膜最里层［13］。

2 隐球菌荚膜致病机制

一般认为隐球菌由宿主回到自然环境中后，会通过有性繁殖的方式产生孢子，或芽殖产生荚膜包被较差的子代隐球菌 (直径约1～3 μm)，较小的体积有利于被呼吸道吸入并迅速穿越肺泡间隔而入血，随后其荚膜便开始迅速生长增大 (直径约4～10 μm)以抵御巨噬细胞的吞噬［4，5］。另外，隐球菌老化的荚膜组织还会脱落，其除了抑制宿主巨噬细胞的趋化作用外，还可增加脑脊液的黏稠度、降低其流动性，导致颅内压升高［5］。目前，细胞免疫被认为是人体抵御隐球菌侵袭的主要免疫方式，而单核/巨噬细胞则是人体细胞免疫系统抵御隐球菌侵染最主要的效应细胞，而荚膜的主要成分-GXM起主要的抗吞噬作用［14-15］，研究显示大鼠肺泡巨噬细胞对隐球菌的吞噬效率与其荚膜的大小呈负相关［16］。2009 年，Frases等［17］利用动态散射的技术(dynamic light scattering，LS)首次发现了隐球菌体内抵御巨噬细胞吞噬的机制，隐球菌进入人体后，多糖荚膜会将越来越多的糖类分子聚集在其边缘，形成巨大的多糖结构分子，使外膜沿着轴线向外扩张，隐球菌荚膜增大到一定程度，巨噬细胞便无法将其吞噬。然而，人类对隐球菌侵入人体后是如何利用宿主环境中的葡萄糖等糖类分子合成新的荚膜组织还知之甚少［4，7，17］。

3 影响隐球菌荚膜表型转化的理化因素

除了宿主体内的隐球菌荚膜会主动增长外，微环境中理化因素的改变也可诱使新生隐球菌荚膜生长、增大。5%CO2可诱使培养基中的隐球菌荚膜明显生长、增大，后续动物试验也证明荚膜不相应增大的菌株毒力较低［18］。缺乏铁元素也被证明是促使隐球菌荚膜明显增长的一个影响因素［19］。位于不同器官的隐球菌其荚膜增大程度也有所不同，肺部的隐球菌荚膜增大最明显［20］，可能与肺组织中低铁、高CO2的微环境有关。值得注意的是，铁元素是酵母真菌生长发育所必须的微量元素，隐球菌在缺铁微环境中荚膜生长增大的现象可能是其通过此种方式增加与外界的接触，以便更有效的吸收铁元素适应环境变化。稀释后的沙氏培养基也能诱使隐球菌荚膜明显生长增大［21］。最近有研究发现二价金属离子浓度，如Ca2+浓度可影响隐球菌荚膜增大的趋势，适当浓度的Ca2+可以促进荚膜增大［22］，这与二价金属离子可能影响侵袭态时新生隐球菌多糖荚膜GXM片段的聚集有关。微碱性的环境亦可诱使隐球菌荚膜生长增大［21］，这可能与隐球菌荚膜生长需要离子态的葡萄糖醛酸有关。然而，以上研究发现荚膜生长增大的同时，隐球菌芽殖的比例却明显降低［4］，此现象提示隐球菌荚膜生长增大还可能是其对恶劣生长环境的适应。另外，高盐或高糖(10%葡萄糖)的微环境可显著缩小隐球菌的荚膜［21］。由于多糖荚膜的增大是不可逆的，隐球菌通过芽殖产生适当大小荚膜的子代，亲代荚膜仍维持原来大小［23］。

研究显示，荚膜生长增大时需要大量的原料物质运至荚膜表面，荚膜生长配流程中GXM可能在细胞内合成并通过小囊泡运送至细胞外围［24-25］，以保证能包绕迅速增长的体积和表面积［4］。Gates等［26］诱导荚膜增大后发现荚膜内出现密度差，最致密的区域出现于靠近细胞壁部分，然后向外逐渐减低，荚膜内层密度比外层高近6倍。然而Zaragoza等［27］对C3补体成分标记的荚膜生长研究显示，在荚膜增大期间其并没有迁移，这个结果提示这种新的多糖是外来加入到C3位置上去的，实验中以代谢性放射标记荚膜多糖，结果是外层荚膜随着γ射线移动，C3补体成分通过共价键结合荚膜多糖，和大多数放射性标记物在荚膜外侧结合对比，暗示其正在荚膜边缘生长发育，荚膜生长动物实验中也观察到新的抗原决定簇出现于荚膜边缘［10］，这与 Frases等［17］的研究结论一致。另外，cAMP－蛋白激酶A和MAPK等［26］信号转导途径也可以影响荚膜的生长，cAMP途径突变株荚膜不增大，其毒力亦降低，而使荚膜过度生长的突变株则毒力较高［28］。

4 隐球菌荚膜表型转化的分子机制

隐球菌荚膜的主要结构组成已经明晰，但其在宿主体内迅速生长增大的分子机制人类却还未揭示。过去十年来，人类试图从影响隐球菌宿主体内荚膜生长的多糖合成代谢途径及其关键调控基因或蛋白质群的角度解析该现象，虽然取得了一些有意义的成果，但总体而言仍是任重道远。根据隐球菌全基因组信息分析，估计至少有30余个基因参与荚膜的合成及调控［29］。自隐球菌第一个荚膜合成必须基因CAP59被鉴定之后，CAP64、CAP10及CAP60等4种荚膜合成必须基因都先后被克隆出来，但其编码产物确切的分子机制目前仍不清楚［30-31］。CAP59已知的功能是编码一种跨膜转运蛋白，负责从菌体内向外输送GXM等［30-33］。另外还有10余种基因参与荚膜合成及结构重塑，如CAS1及CAS3基因参与GXM的乙酰化调控;而UXS1、UGD1、CAS31、CAS32、CAS33、CAS34及CAS35基因则参与GXM木糖基化的调控［7］。而从酶的角度来讲，隐球菌荚膜生长过程中从单糖分子到结构复杂的GXM等多糖分子必然需要大量糖基转移酶的参与，然而目前人类只明确了其中的一种，即木糖基转移酶1(Cxt1p)［34］。因此，隐球菌荚膜生长增大相关多糖合成代谢分子机制领域还迫切需要继续研究探讨。

5 总结及展望

进入宿主体内后，荚膜生长增大是隐球菌适应人体内环境压力、抵御免疫系统杀伤的最主要策略之一，也是一个复杂的、精确调控的多糖合成代谢及耗能的过程。利用现代分子生物学技术结合生物信息学分析开展隐球菌未知功能基因的研究，尤其是荚膜侵袭态生长增大分子机制的研究，有着巨大的可探索空间，对提高隐球菌病临床诊治水平，维护人民生命健康具有重要意义。

［1］Kronstad JW，Attarian R，Cadieux B，et al.Expanding fungal pathogenesis:Cryptococcusbreaks out of the opportunistic box［J］.Nat Rev Microbiol，2011，9(3):193-203.

［2］Dromer F，Mathoulin-Pelissier S，Launay O，et al.Determinants of disease presentation and outcome during cryptococcosis:the CryptoA/D study［J］.PLoS Med，2007，4(2):e21.

［3］Lortholary O，Poizat G，Zeller V，et al.Long-term outcome of AIDS associated cryptococcosis in the era of combination antiretroviral therapy［J］.AIDS，2006，20(17):2183-2191.

［4］Zaragoza O，Rodrigues ML，De Jesus M，et al.The capsule of the fungal pathogenCryptococcus neoformans［J］.Adv Appl Microbiol，2009，68:133-216.

［5］Ma H，May RC.Virulence inCryptococcusspecies［J］.Adv Appl Microbiol，2009，67:131-190.

［6］Maxson ME，Cook E，Casadevall A，et al.The volume and hydration of theCryptococcus neoformanspolysaccharide capsule［J］.Fungal Genet Biol，2007，44(3):180-186.

［7］Doering TL.How sweet it is!Cell wall biogenesis and polysaccharide capsule formation inCryptococcus neoformans［J］.Annu Rev Microbiol，2009，63:223-247.

［8］Frases S，Nimrichter L，Viana NB，et al.Cryptococcus neoformanscapsular polysaccharide and exopolysaccharide fractions manifest physical，chemical，and antigenic differences［J］.Eukaryot Cell，2008，7(2):319-327.

［9］McFadden D，Zaragoza O，Casadevall A ，et al.The capsular dynamics ofCryptococcus neoformans［J］.Trends Microbiol，2006，14(11):497-505.

［10］McFadden DC，Fries BC，Wang F，et al.Capsule structural heterogeneity and antigenic variation inCryptococcus neoformans［J］.Eukaryot Cell，2007，6(8):1464-1473.

［11］McFadden DC，De Jesus M，Casadevall A.The physical propertiesofthe capsularpolysaccharidesfromCryptococcus neoformanssuggest features for capsule construction［J］.J Biol Chem，2006，281(4):1868-1875.

［12］Murphy JW.Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity［J］.Rev Infect Dis，1988，10(Suppl 2):S432-435.

［13］Ma H，Croudace JE，Lammas DA，et al.Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages［J］.Curr Biol，2006，16(21):2156-2160.

［14］Mansour MK，Levitz SM.Interactions of fungi with phagocytes［J］.Curr Opin Microbiol，2002，5(4):359-365.

［15］Shao X，Mednick A，Alvarez M，et al.An innate immune system cell is a major determinant of species-related susceptibility differences to fungal pneumonia ［J］.J Immunol，2005，175(5):3244-3251.

［16］Feldmesser M，Kress Y，Casadevall A.Dynamic changes in the morphology ofCryptococcus neoformansduring murine pulmonary infection［J］.Microbiology，2001，147(8):2355-2365.

［17］Frases S，Pontes B，Nimrichter L，et al.A Capsule ofCryptococcus neoformansgrows by enlargement of polysaccharide molecules［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(4):1228-1233.

［18］Granger DL，Perfect JR，Durack DT.Virulence ofCryptococcus neoformans.Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide［J］.J Clin Invest，1985，76(2):508-516.

［19］Vartivarian SE，Anaissie EJ，Cowart RE，et al.Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron［J］.J Infect Dis，1993，167(1):186-190.

［20］Rivera J，Feldmesser M，Cammer M，et al.Organ-dependent variation of capsule thickness inCryptococcus neoformansduring experimental murine infection［J］.Infect Immun，1998，66(10):5027-5030.

［21］Zaragoza O，Casadevall A.Experimental modulation of capsule size inCryptococcus neoformans［J］.Biol Proced Online，2004，6(1):10-15.

［22］Nimrichter L，Frases S，Cinelli LP，et al.Self-aggregation ofCryptococcus neoformanscapsular glucuronoxylomannan is dependent on divalent cations［J］.Eukaryot Cell，2007，6(8):1400-1410.

［23］Zaragoza O，Telzak A，Bryan RA，et al.The polysaccharide capsule of the pathogenic fungusCryptococcus neoformansenlarges by distal growth and is rearranged during budding［J］.Mol Microbiol，2006，59(1):67-83.

［24］Griffith CL，Klutts JS，Zhang L，et al.UDP-glucose dehydrogenase plays multiple roles in the biology of the pathogenic fungusCryptococcus neoformans［J］.J Biol Chem，2004，279(49):51669-51676.

［25］Yoneda A，Doering TL.A eukaryotic capsular polysaccharide is synthesized intracellularly and secreted via exocytosis［J］.Mol Biol Cell，2006，17(12):5131-5140.

［26］Gates MA，Thorkildson P，Kozel TR.Molecular architecture of theCryptococcus neoformanscapsule［J］.Mol Microbiol，2004，52(1):13-24.

［27］Zaragoza O，Fries BC，Casadevall A.Induction of capsule growth inCryptococcus neoformansby mammalian serum and CO2［J］.Infect Immun，2003，71(11):6155-6164.

［28］Kozubowski L，Lee SC，Heitman J.Signalling pathways in the pathogenesis ofCryptococcus［J］.Cell Microbiol，2009，11(3):370-380.

［29］Loftus BJ，Fung E，Roncaglia P，et al.The genome of the basidiomycetous yeast and human pathogenCryptococcus neoformans［J］.Science，2005，307(5713):1321-1324.

［30］Chang YC，Kwon-Chung KJ.Isolation of the third capsule-associated gene，CAP 60，required for virulence inCryptococcus neoformans［J］.Infect Immun，1998，66(5):2230-2236.

［31］Chang YC，Kwon-Chung KJ.Isolation，characterization，and localization of a capsule-associated gene，CAP 10， ofCryptococcus neoformans［J］.J Bacteriol 1999，181(18):5636-5643.

［32］Chang YC，Kwon-Chung KJ.Complementation of a capsule-deficient mutation ofCryptococcus neoformansrestores its virulence［J］.Mol Cell Biol，1994，14(7):4912-4919.

［33］Chang YC，Penoyer LA，Kwon-Chung KJ.The second capsule gene ofCryptococcus neoformans，CAP 64，is essential for virulence［J］.Infect Immun，1996，64(6):1977-1983.

［34］Klutts JS，Doering TL.Cryptococcal xylosyltransferase 1(Cxt1p)fromCryptococcus neoformansplays a direct role in the synthesis of capsule polysaccharides［J］.J Biol Chem，2008，283(21):14327-14334.