超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中三种农药残留

刘伟悦

北京张一元金桥茶叶有限公司（北京 101102）

我国是茶树原产地，茶叶生产历史悠久。茶叶作为一种健康饮品，深受全世界消费者的喜爱。茶叶中不仅富含茶多酚及儿茶素，还含有钾、钙、镁、锰等多种矿物质。茶叶也是我国重要的经济作物和出口农产品。作为我国茶叶的重要进口国，欧洲和日本制定了极为严苛的农药残留限量标准。欧盟标准和日本肯定列表中关于茶叶的农残项目分别为480种[1-2]和276种，农残限量在0.01～30.0 mg/kg之间，国际食品法典委员会农残限量（CAC）在0.01～50.0 mg/kg之间，对于没有明确规定农药残留限量的农药一律采用不得大于0.01 mg/kg的标准。目前，我国最新版国家强制性标准GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[3]中涉及茶叶中农药最大残留限量已经达到106种，农药残留限量在0.01～50.0 mg/kg之间，对未涉及农药残留限量的农药没有具体规定。

为了提高茶叶产量，农药在茶叶病虫防治中得到了广泛使用，敌敌畏、乐果和喹硫磷均为有机磷类农药，广泛应用于茶叶中的杀虫、杀螨剂，由此带来的农药残留可能危害消费者健康。随着生活水平日益提高，人们对茶叶的质量和安全性都有了更高的要求[4]。农药残留分析作为一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术。目前，国内外农药残留的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法等[5-6]。其中，液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法利用被测样品离子质荷比，定性定量更加准确，检测灵敏度更高，对于茶叶类复杂基质中农药残留检测有其独特的技术优势。

研究建立了适用于检测茶叶中农药残留的超高效液相色谱-串联质谱法，该方法简单快速、分离度好、重现性好、精密度高，可满足同时检测茶叶中敌敌畏、乐果和喹硫磷3种农药残留的要求[7-13]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丙酮中敌敌畏、乐果、喹硫磷质量浓度均为1 000 μg/mL（农业部环境保护科研监测所）；乙腈、丙酮、甲醇、甲苯、甲酸[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；纯净水（杭州娃哈哈有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，北京化工厂），经550 ℃灼烧4 h，储存于干燥器中，冷却后备用；Cleanert TPT固相萃取柱（Agela公司）；0.22 μm尼龙微孔过滤膜（津腾公司）。

UPLC/TSQ Quantum U1tra超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪[配有电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur工作站软件，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；Hypersil GOLD C8色谱柱[100 mm×2.1 mm，1.9 μm，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；RE-2000B旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；QL-901涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XHF-DY高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KH-100DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；SE202F电子分析天平（奥豪斯）；TDL-40B台式低速离心机（飞鸽牌）；HY-5A型回旋式振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 待测液制备

称取粉碎均匀的试样5 g（精确至0.01 g），用20.0 mL的乙腈振荡提取1 h，在4 000 r/min下离心5 min。取4 mL上清液，过Cleanert TPT固相萃取柱（萃取柱中加入约2 cm高无水硫酸钠，用10 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脱液预洗，弃去流出液）净化，用20 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脱，收集洗脱液，40 ℃条件下水浴，旋蒸至近干，乙腈+水（3+2，V/V）定容1 mL，过0.22 μm微孔过滤膜，混匀，待UPLC-MS/MS测定，以基质标准溶液工作曲线定量。

1.2.2 标准曲线的绘制

混合标准储备液的配制：将1 000 μg/mL丙酮中敌敌畏、乐果、喹硫磷农药标准溶液稀释为100 μg/mL标准储备液于-20 ℃保存。分别吸取乐果和喹硫磷标准储备液100 μL加入10.0 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得到1 μg/mL的混合标准工作溶液A，同样方法得到1 μg/mL的敌敌畏、乐果、喹硫磷混合标准工作溶液B，于-20 ℃保存。

基质标准曲线的制备：同1.2.1小节待测液制备的方法，用未检出待测农药的绿茶样品制作基质空白溶液，分取16 mL上清液过柱，20 mL乙腈+甲苯（3+1）洗脱，用乙腈+水（3+2）定容至8 mL，过0.22 μm滤膜，所得溶液为基质空白溶液。准确配制基质空白中3种农药的质量浓度为10，20，50，100，200，400和600 μg/L进行测定。

1.2.3 液相色谱条件

Hypersil GOLD C8色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。流动相组成：流动相A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈。流动相梯度洗脱程序见表1；色谱柱温度40oC，进样量为5 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.4 质谱条件

电离方式ESI+；喷雾电压：3 200 V；离子传输管温度：320 ℃；蒸发温度300 ℃；鞘气：氮气，流量630 L/h；辅助气：氮气，流量180 L/h；碰撞气：氩气，碰撞气压力1.5 mTorr；氮气和氩气纯度均大于99.999%；选择离子多反应监测模式扫描（SRM）。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件的优化

在优化好的色谱条件下，采用全扫描Full Scan方式对单一标准溶液2 μg/mL进样，获得化合物的特征离子，选择离子丰度最高的[M+H]+m/z作为母离子；然后进行产物离子扫描，找到特征离子及其最佳CE。试验选择每种化合物丰度较高的两个离子分别作为定量离子和定性离子。化合物英文名称、保留时间及质谱参数见表2。

表2 保留时间和质谱参数

2.2 提取过程的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

在农药残留提取的过程中，根据农药的极性、性质等因素选择合适的提取溶剂。在农药残留检测的过程中，常见的提取溶剂有乙腈、丙酮、甲醇、正己烷、石油醚等，研究以回收率为参考指标，回收试验添加质量分数水平为0.1 mg/kg，用乙腈、丙酮和甲醇3种有机溶剂作为提取溶剂分别做3平行试验，回收率见图1。

从图1可以看出，甲醇作为提取剂时乐果和喹硫磷回收率极低，敌敌畏回收率为零。由于甲醇的溶解性较好，在提取的过程中，提取液比较浑浊，最后定容，待上机的溶液会分层，这可能是导致三种农残回收率都很低的原因。乙腈和丙酮提取的回收率比较接近，但是乙腈对于色素和油脂的提取能力不强，因此可以减小杂质的干扰，提取的回收率整体更优于丙酮，因此选择乙腈作为提取溶剂。

图1 三种提取溶剂农残回收率对比（n=3）

2.2.2 提取方式的优化

研究以回收率为参考指标，回收试验添加质量分数水平为0.1 mg/kg，用超声、振荡和均质三种方式提取，分别做3组平行试验，回收率见图2。

图2 三种提取方式农残回收率对比（n=3）

从图2可以看出，超声提取方式对乐果的回收率相对较低，均质提取方式对喹硫磷的回收率相对较高，这可能是超声和均质提取方式使一部分干扰物被提取出来，增强了茶叶的基质干扰。而通过振荡提取的方式，三种农药的回收率表现良好。因此，试验选择振荡提取。

2.2.3 洗脱液提体积的优化

研究以回收率为参考指标，回收试验添加质量分数水平为0.1 mg/kg，用乙腈+甲苯（3+1，V/V）作洗脱液，Cleanert TPT固相萃取柱进行净化，洗脱液体积分别为10，15，20，25和30 mL，分别做3组平行试验，回收率见图3。

从图3可以看出，喹硫磷的回收率受洗脱液体积影响较小。对于乐果和敌敌畏，随着洗脱液体积的增加，其平均回收率总体呈上升趋势；但超过20 mL之后，随着洗脱液体积的增加，其回收率变化不明显。基于添加回收率要求和试验操作的实际需求，选择20 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）作为洗脱液。

图3 洗脱液体积对农残回收率的影响（n=3）

2.3 标准曲线与线性范围

按上述方法配制标准曲线，以目标组分的响应面积（y）和对相应的质量浓度（x，μg/L）绘制标准曲线。结果发现，三种农药的质量浓度在10～600 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99。以10倍信噪比（S/N）计算方法的定量限[14-20]，茶叶中三种农药线性回归方程、相关系数、定量限和限值见表3。

表3 茶叶中3种农药线性回归方程、相关系数、定量限和限值

2.4 加标回收和精密度

选择空白样品进行加标处理，处理方法同待测液的制备方法。按照所建立的方法处理、测定，加标水平为0.01，0.02，0.1和0.4 mg/kg，每个加标量重复6次，验证方法的精密度。空白样品中3种农药加标回收结果见表4。从表4中可以看出，3种农药的加标回收率在68.7%～114.9%之间，精密度为2.7%～10.8%。回收率和精密度均符合农药残留检测要求。

表4 农药加标回收率及精密度

2.5 5种茶叶样品加标回收率分析

对绿茶、红茶、茉莉花茶、大红袍和普洱生茶5种茶叶进行3种农残加标试验。制备均匀样品，采用此方法提取、净化、上机测试，添加水平及回收率见表5。从表5中可以看出，5种茶叶中3种农药的回收率在66.6%～113.6%之间，表明此方法可用于茶叶中3种农药残留的同时检测。

表5 5种茶叶加标回收

2.6 样品测定

随机抽取绿茶、红茶、黑茶、乌龙茶、白茶、茉莉花茶等六种茶样，共198批次，采用上述建立的检测方法对样品进行检测。结果表明，敌敌畏、乐果和喹硫磷均未被检出。

3 结论

用乙腈振荡提取1 h，Cleanert TPT固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法检测，建立了茶叶中同时测定乐果、敌敌畏和喹硫磷残留量的测定方法，且方法线性相关性好、简单快捷、灵敏度高，在回收率、定量限和精密度等方面均能满足我国、欧盟和日本等国家对于茶叶中农药残留量的检测要求。研究一方面可为茶叶产品标准的完善提供数据，另一方面可为监管部门对茶叶产品的风险监测提供方法参考。