高F值牡蛎寡肽酶解条件优化

刘雄飞，张铁涛，武天明

海南热带海洋学院食品科学与工程学院（三亚 572022）

高F值寡肽是指利用酶解生物蛋白制备3～9个氨基酸残基（F值大于20）组成的寡肽的混合物。F值是指混合物中支链氨基酸（BCAA，即亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）与芳香族氨基酸（AAA，即苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）物质的量比值[1]。高F值寡肽的主要特征是氨基酸混合物中BCAA与AAA比值远高于人体模式，在临床上的应用已从最初的保肝护肝、辅助肝性脑病及苯丙酮尿症治疗延伸到抗疲劳、抗衰老及其他生物活性领域[2]。利用大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hy-pogaea）等植物蛋白制备高F值寡肽，并进一步开发功能食品成为研究焦点[3]。现以牡蛎蛋白为主要原料，通过优化活性炭脱除牡蛎蛋白酶解液中芳香族氨基酸的最佳吸附条件，探讨温度、时间、固液比等因素影响，获取较优高F值牡蛎寡肽的酶解条件，为高F值寡肽的开发奠定理论基础，为牡蛎系列产品深加工技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

香港巨牡蛎（海南省三亚市旺豪超市）；胰酶（国药集团化学试剂有限公司）；活性炭（西陇化工股份有限公司）；邻苯二甲酸氢钾（上海仪电科学仪器股份有限公司）；混合磷酸盐（上海仪电科学仪器股份有限公司）；氢氧化钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；盐酸（西陇化工股份有限公司）、无水乙醇（西陇科学股份有限公司）；所用分析试剂均为分析纯。

ME204E/02电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DZ-500/1S真空包装机（上海运驰包装机械有限公司）；X85-2s磁力搅拌器（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；Multifuge X1R高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；PB-10 Sartorius普及型pH计（Sartorius科学仪器股份有限公司）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HWS-26数显恒温水浴锅（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；Pilot7-12M真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 高F值牡蛎寡肽的生产工艺流程

牡蛎肉→预处理→酶解→调pH→活性炭处理→离心→过滤→高F值寡肽

1.2.2 原料预处理

牡蛎清洗干净、匀浆，煮沸20 min，转移到三角瓶中，置于冰箱中备用。

1.2.3 固液比对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

选择固液比1∶10，1∶30，1∶50，1∶70，1∶90和1∶110（g/mL），控制温度30 ℃，调节pH 2.0，吸附处理4 h，选择A220/A280较高条件下为最佳固液比。

1.2.4 pH对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

pH为2.0～10.0（梯度为2.0），控制温度30 ℃、固液比1∶30（g/mL），吸附4 h，分析不同条件下寡肽液A220/A280高低，选择较优pH。

1.2.5 吸附时间对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

使用不同的吸附时间检测对吸附效果的影响，通过胰酶处理牡蛎酶解液，控制温度30 ℃，固液比1∶30（g/mL），调节pH 2.0，分别吸附处理1，2，3，4和5 h，在8 000 r/min条件下处理20 min，取上清液，分析不同条件下寡肽液A220/A280高低，选择较优吸附时间[4]。

1.2.6 温度对对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

使用不同的温度检测对吸附效果的影响，通过胰酶处理牡蛎酶解液，控制固液比1∶30（g/mL）、pH 2.0，分别在25，35，45，55和65 ℃条件下处理4 h，在8 000 r/min条件下处理20 min，取上清液，分析不同条件下寡肽液A220/A280高低，选择较优吸附温度。

1.2.7 三因素三水平正交试验

为保证试验的精准性，在单因素的基础上进行正交试验，以BCAA保留率和AAA去除率情况作为主要测量指标，采用三水平三因素试验进行优化，优选固液比、pH和时间进行正交优化试验，试验因素水平表如表1所示。由此确定最优条件。

表1 三因素三水平试验设计表

1.2.8 活性炭筛选

选取6种不同的类型活性炭，静态吸附方式，以BCAA保留率和AAA去除率为主要评价指标，通过计算AAA和BCAA的吸光度平均值，选择A220/A280较高值，初步筛选活性炭类型[5]。

1.2.9 AAA去除率和BCAA保留率测定

一般的寡肽类混合物中，芳香族肽类氨基酸和支链氨基酸在测定荧光波长值分别为λ=280 nm和λ=220 nm的特殊情况下的2个波长上，具有最高的吸收特征性质和吸收峰，其他的肽类氨基酸在这一波长条件下并没有被直接吸收，酶解后样品在转速8 000 r/min下处理20 min，取上清液用紫外可见分光光度计测定寡肽聚合物中AAA和BCAA的吸光度，通过式（1）和（2）可计算AAA去除率和BCAA保留率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 活性炭类型对吸附脱芳后寡肽液A220/A280的影响

选用6种0.075 0 mm孔径（200目）活性炭作为吸附材料，对比表2不同活性炭的吸附效果，活性炭1吸附脱芳后寡肽液A220/A280值显著高于其他5种活性炭。高F值寡肽的制备需要在去除芳香族氨基酸的同时，尽量保留支链氨基酸。因此，选用活性炭1作为吸附剂。进一步分析发现，虽然6种活性炭都是粉末状，但是活性炭1的粉末较为粗大，相对而言可以更好地保留BCAA[6]，基于此选取活性炭1作为吸附活性炭材料。

表2 不同活性炭吸附脱芳后寡肽液A220/A280

2.1.2 固液比对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

由表3可知，随着固液比增加，固液比为1∶30（g/mL）吸附脱芳后寡肽液A220/A280出现较明显的下降，其活性炭含量逐步变少，显示出其对AAA吸附的能力逐步下降，而BCAA保留率则逐步提高，反之亦然。为确保有相对较高BCAA的同时尽可能地降低AAA含量，综合试验结果最佳固液比为1∶30（g/mL）[7]。

表3 不同固液比对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

2.1.3 pH对对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

从表4中A220/A280数值变化可知，随着溶液酸碱度增加，AAA去除率逐渐下降而BCAA保留率却在缓慢增加[8]，综上可知溶液pH 2.0时A220/A280值最高，因此优选最佳溶液pH 2.0。

表4 不同pH对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

2.1.4 吸附时间对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

从表5中数据可知，随吸附时间持续推移，A220/A280数值逐渐增大，4 h增大不明显，可能是由于随吸附时间的推移，吸附已逐渐变得趋于饱和，进行一种继续性和扩大性的吸附，但时间对其他吸附物质样品吸附时间效果的变化影响并不明显，因此，综合考虑，最佳吸附时间为4 h。

表5 不同吸附时间对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

2.1.5 温度对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

从表6中A220/A280可知，随着温度增加，BCAA保留率呈现先下降后增加趋势，但变化并不明显，而AAA去除率则呈现先增加后下降的趋势。由于在试验过程中温度升高会对溶质的热稳定性产生一定影响，而温度指标对BCAA保留率和AAA去除率的影响又不是特别明显[9]，基于此，最终温度为25 ℃。

表6 不同温度对脱芳后寡肽液A220/A280的影响

2.2 三因素三水平正交试验

高F值牡蛎寡肽正交试验结果如表7所示。根据K值大小，理论最优水平为A1B3C2，这与正交试验结果A1B3C3时A220/A280最高达到2.26，二者有一定的偏差，相差不大，结合前面单因素分析结果，可近似忽略。

表7 高F值牡蛎寡肽正交试验结果

由极差分析可知，时间为影响最大的条件，极差值为1.44，pH的影响显著性最小，仅为0.09，分析得知影响高F值牡蛎寡肽的主要因素为吸附时间＞固液比＞pH。最佳理论制备工艺参数为固液比1∶10（g/mL），pH 3.0、吸附时间5 h。

3 结论

所选择的6种活性炭均展现出较强的BCAA保留能力和AAA吸附能力，试验筛选出活性碳1效果最好。单因素试验获取较优的固液比1∶30（g/mL）、pH 2.0、吸附温度25 ℃、吸附时间4 h。三因素三水平正交试验极差结果分析表明，较优的提取条件为固液比1∶10（g/mL）、pH 3.0、吸附温度25 ℃、吸附时间5 h，其中影响因素顺序为时间＞固液比＞pH。