“宁玉”草莓单茎尖培养技术研究

楚宗丽，李亮杰，詹 妞，陈娟娟，董向向，朱庆松

(信阳农林学院/信阳市草莓工程技术研究中心，河南信阳，464006)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是世界各地广泛栽培生产的一种小浆果，果实色泽鲜艳，柔软多汁，酸甜适口，含有丰富的营养，食用部分达到了97%，是当今世界十大水果之一，有“水果皇后”之称[1]。中国是世界上最大的草莓生产国，从1994年以来年产量一直居世界第1位[2]。据中国园艺学会草莓分会的最新统计，2020年中国草莓种植总面积为17.87万hm2。“宁玉”是江苏省农业科学院选育的一个具有早熟、高产、抗病、优质特点的草莓品种[3]，在河南、河北、江苏、安徽、四川、上海等地种植较多，深受种植户和消费者的欢迎。在草莓的栽培过程中，有几十种病毒可以侵染草莓，部分病毒病会使草莓叶片黄化、畸形皱缩，影响产量和品质，严重时可能会导致大幅度减产，甚至整株死亡[4]。常见的草莓病毒病有：草莓镶脉病毒、草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草莓轻型黄边病毒[5]。单独侵染时的危害程度，以草莓斑驳病毒最大，可导致草莓减产约30%[6]。当多种病毒混合侵染时，危害更大。草莓种苗脱毒是解决病毒病危害的主要途径。脱毒方法有很多种，其中最常用的是茎尖组培快繁脱毒。White[7]发现病毒在植物体内分布不均匀，越靠近尖端病毒越少；植物茎尖分生组织由不断分裂的细胞组成，其生长旺盛、细胞分裂快，受病毒浸染机率较低，剥取的茎尖越小，脱毒效果较好。然而，草莓在增殖培养的过程中，会出现“丛生苗”“花而不实”“畸形果增多”等有害变异，严重影响了组培苗在生产中的应用。针对草莓组培变异问题，胡盼盼等[8]提出了2种解决途径：(1)控制变异发生的培养条件，控制增殖系数，减少继代次数；(2)改变组培脱毒苗生产流程，采用单茎尖培养，即不再进行组培快繁，仅在脱毒环节进行茎尖组培，一个茎尖只培育一株种苗，经病毒检测确定不带病毒后生根驯化移栽，然后在隔离网室的无土基质上繁殖一代种苗。采用单茎尖离体培养是解决草莓组培变异的有效途径之一，目前对这种方法的研究尚未见报道。笔者用“宁玉”草莓茎尖进行初代培养、壮苗培养和生根培养，筛选适宜的培养基配方，同时探索驯化移栽方法，试图建立草莓单茎尖离体培养体系，为这一途径的实施提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料选取与处理

材料取自信阳市十三里桥乡草莓基地，取样时间为10月中旬。在晴天下午，田间选择生长健壮、无病虫害且符合本品种特性的“宁玉”草莓母株，剪取生长充实、顶端悬空而叶小未展开的匍匐茎。从匍匐茎顶端剪取1.0 cm的茎尖，置于流水下冲洗2 h，在超净工作台用75%乙醇浸泡30 s，然后用0.10%升汞溶液浸泡5～8 min，最后用无菌水冲洗3～5遍。试验时剥取1.0～2.0 mm茎尖。

1.2 试验设计

1.2.1 初代培养6-BA浓度筛选 以MS为基本培养基，均添加NAA 0.05 mg/L。设置3个6-BA浓度处理：0、0.20和0.40 mg/L。各配方培养基添加蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH值为5.8，125 ℃条件下灭菌23 min，冷却备用(下同)。剥取灭菌好的茎尖接入培养瓶，垂直插入培养基中，深度为外植体的1/2，每瓶接种3个，每处理每重复接种30株，3次重复，全部完成后放入培养室培养。培养条件：白天温度22～26 ℃，夜间不低于20 ℃，光照强度为2 400～2 900 lx，每天光照时间14 h，相对空气湿度40%～60%。培养4周后，观察茎尖的生长状况，统计萌发数，计算萌发率，并观察不同处理的生长状况。萌发率(%)=(成活茎尖数/接种茎尖数)×100。

1.2.2 壮苗培养NAA浓度筛选 以MS为基本培养基，均添加6-BA 0.10 mg/L。设置3个NAA浓度处理：0.05、0.10和0.20 mg/L。在超净工作台上，将初代培养的苗切去愈伤组织和下部的叶片，注意不要把苗切散，竖直接入壮苗培养基中，外植体插入深度5 mm左右，每处理每重复接种20株，3次重复，置于培养室，培养条件同初代培养。培养3周后，观察并记录不同处理的长势，统计壮苗(茎粗壮，叶绿而厚)数，计算壮苗率。壮苗率(%)=(壮苗数/接种幼苗数)×100。

1.2.3 生根培养NAA浓度筛选与驯化移栽 以1/2 MS为基本培养基，均不添加6-BA。设置3个NAA浓度处理：0.05、0.10和0.20 mg/L。当茎尖苗长到3 cm左右高时在生根培养基上进行生根。用解剖刀切去愈伤组织和下部的叶片，注意不要把苗切散，竖直接入生根培养基中，外植体插入深度5 mm左右，每处理每重复接种20株，3次重复，置于培养室培养，培养条件同初代培养。培养4周后，观察不同处理的长势并记录，统计生根率、生根数与平均根长。生根率(%)=(生根数/接种数)×100。

将生根培养4周、苗高4 cm以上、根系发达、长出3～5片叶的健壮幼苗移进温室进行驯化移栽。温室温度控制在白天22～25 ℃，夜晚12～15 ℃，白天打开遮阳网遮阴防晒，第1天不打开瓶盖，第2天打开瓶盖，每天早、中、晚各喷水雾1次，开盖炼苗3 d后，用镊子取出幼苗，将根系附着的培养基洗净，移植在穴盘育苗基质上(按泥炭∶珍珠岩∶蛭石=1∶1∶1的比例配基质，装入50穴的穴盘里，用85%多菌灵1 000倍液浇透基质，然后移栽)。移栽后，注意保湿遮阴，每天早、中、晚各喷水1次保湿，持续5 d；每周喷施1次叶面肥。移栽30 d后统计成活率。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 26软件进行统计分析，用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检验(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 6-BA浓度对初代培养效果的影响

调查结果看出，经过4周的培养，B处理的萌发率最高，幼苗长势良好，较粗壮，无增殖芽，A处理与C处理的萌发率偏低且两者无明显差异。从长势上来看，不含6-BA 的A处理长势弱，生长慢；当6-BA浓度为0.20 mg/L时(B处理)，幼苗长势好，叶片大而绿；随着6-BA浓度增加到0.40 mg/L时(C处理)，苗变得短缩，并且有增殖芽，不利于单茎尖培养(见表1和图1)。综合来看，MS+6-BA 0.20 mg/L+NAA 0.05 mg/L更适宜“宁玉”草莓茎尖萌发。

表1 6-BA浓度对“宁玉”草莓茎尖萌发的影响

图1 初代培养6-BA浓度对“宁玉”草莓茎尖萌发的影响

2.2 NAA浓度对壮苗培养效果的影响

调查结果看出，经过3周的培养，E处理的壮苗率最高，幼苗生长速度较快，茎干粗壮，叶片较大，长势好；D处理的壮苗率较低，幼苗茎干较细，叶片较小；F处理壮苗率也较低，幼苗茎干较粗，叶片较小(见表2和图2)。综合来说，培养基MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.10 mg/L更适宜“宁玉”草莓的壮苗培养。

表2 NAA浓度对“宁玉”草莓壮苗的影响

图2 壮苗培养NAA浓度对“宁玉”草莓壮苗的影响

2.3 NAA浓度对生根培养效果的影响

调查结果看出，经过4周的培养，H处理的生根率、平均根数和平均根长均最大，显著高于G处理和I处理，G处理和I处理之间各指标差异均无显著性(见表3和图3)。另外，I处理形成的愈伤组织较多，在生长中会导致其褐化从而影响生根和成活。因此，培养基1/2 MS +NAA 0.10 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L更适宜“宁玉”草莓幼苗的生根。此外，H处理生根培养4周的健壮幼苗移进温室进行驯化移栽，30 d后的成活率达96%以上(见图4)。

图3 生根培养NAA浓度对“宁玉”草莓幼苗生根的影响

图4 “宁玉”草莓单茎尖培养壮苗驯化移栽后30 d的生长情况

表3 NAA浓度对“宁玉”草莓幼苗生根培养的影响

3 讨论与结论

草莓组培苗生产中发生不良变异的主要因素有增殖系数过大、继代次数过多等[9-10]。采用单茎尖离体培养没有增殖的程序，一个茎尖只培育一株组培苗，减少了不良变异的发生，进一步推动了组培技术在草莓脱毒种苗生产中的应用。草莓单茎尖离体培养中理想的培养基配方是既能壮苗，又不发生增殖。有研究发现，在离体培养中，组培苗不仅受细胞分裂素6-BA的影响，还受生长素NAA的影响；根据6-BA和NAA浓度的配比高低，当两者浓度之比较高，有利于芽的生长，容易诱导出芽；当两者的浓度之比较低时，有利于根的发生，容易诱导出根[11]。可见，6-BA和NAA两者的浓度之比过高或过低对草莓的壮苗培养都不利。同时，不同草莓品种对植物生长调节剂的耐受性不同[12]。张建盈等[12]研究认为，MS + 6-BA 0.50 mg/L + IBA 0.1 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂5.5g/L为“白雪公主”最适宜的诱导培养基和增殖培养基。董敬超[13]研究认为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L为“红颜”草莓适宜的初代培养基，MS+6-BA 0.25 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L为“红颜”适宜的增殖培养基。罗天宽等[14]研究认为，“红颊”草莓试管苗在MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂 7 g/L培养基上的增殖系数最高。

在草莓组织培养中对生长素的研究较多。罗天宽等[14]设置相同6-BA浓度与3种生长素搭配，结果表明各生长素的增殖效果高低顺序为NAA

本试验采用单茎尖培养技术，不设增殖环节，利用NAA活性强的优点，在低浓度(0.05～0.2 mg/L)条件下进行初代培养和壮苗培养，取得了较为理想的培养效果。本试验发现，MS+6-BA 0.20 mg/L +NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L适宜用于“宁玉”草莓茎尖的初代培养，萌发率达71.11%，长势良好，苗壮；MS+6-BA 0.10 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L的壮苗效果较好，壮苗率达88.33%，茎干粗壮，叶片较大，且没有增殖芽。这为解决组培苗生产中容易发生不良变异的问题提供了技术参考。

在草莓生根培养中，培养基一般采用1/2 MS效果较好，主要是探究不同的生长素浓度对生根的影响。董敬超[13]研究表明“红颜”草莓最适宜的生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L。吴雪[15]等研究发现，“红花”草莓最适宜的生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L。夏瑾[16]等研究发现，“宁玉”草莓组培快繁采用1/2MS + NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L培养基的生根效果最好。本试验发现，“宁玉”草莓最适宜的生根培养基配方是1/2 MS +NAA 0.10 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L，与董敬超[13]在“红颜”草莓上、吴雪[15]等在“红花”草莓上的研究结果一致，与夏瑾[16]在“宁玉”草莓上的研究结果有一定的差异。这种差异，可能是因为夏瑾[16]在研究中NAA浓度最高用到0.05 mg/L所致。

本研究筛选出的一组适合“宁玉”草莓单茎尖离体培养的培养基配方(初代培养适宜的培养基配方为MS + 6-BA 0.20 mg/L + NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L，壮苗培养适宜的培养基配方为MS + 6-BA 0.10 mg/L + NAA 0.10 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L，生根培养适宜的培养基配方为1/2 MS + NAA 0.10 mg·L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L)，可为建立“宁玉”草莓单茎尖离体培养技术体系提供参考。