负载酪氨酸酶抑制肽的牛奶外泌体抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成研究

栗瑞斌，王倩，张雷杰，荆韧威，尹海芳

（天津医科大学基础医学院细胞生物学系，天津 300070）

黑色素是在黑色素细胞内生成的一种生物色素[1]，黑色素在皮肤的沉积会造成皮肤暗沉等相关问题。抑制黑色素产生是现阶段化妆品行业达到美白效果的重要方式。在黑色素产生的过程中，酪氨酸酶起主要作用[2]。同时，由于酪氨酸酶只表达于黑色素细胞内，靶向酪氨酸酶的抑制剂可以特异性地抑制细胞中的黑色素生成而不会产生不良反应。现阶段，通过靶向抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑色素的产生成为了美白皮肤的重要思路。熊果苷是一种天然的酪氨酸酶抑制剂分子，可以有效抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生成。然而，天然的熊果苷在化学组成上不稳定，可分解为苯代谢物，对骨髓具有一定的毒害作用[3-5]。对苯二酚虽然也可以有效抑制酪氨酸酶活性，但会引起哺乳动物的组织坏死，并会导致许多不良反应，包括色斑、接触性皮炎[6-9]。由于以上酪氨酸酶抑制剂具有较大的不良反应，所以更为安全的蛋白类酪氨酸酶抑制剂成为有效抑制酪氨酸酶活性的研究重点。研究报道，酪氨酸酶抑制肽YRS（YRSRKYSSWY）可以显著抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的产生[9]。但由于其渗透性差，无法递送至皮肤基底层，无法被细胞高效摄取以及无法与酪氨酸酶高效共定位，导致其在体内抑制酪氨酸酶的作用不明显。目前，如何促进短肽类酪氨酸酶抑制剂渗透皮肤基底层，与酪氨酸酶实现高效共定位，提高其抑制酪氨酸酶活性的效果，成为了减少黑色素生成的关键。

近年来，外泌体（exosome）作为细胞分泌的天然纳米级生物小囊泡，因其具有多种生物活性分子，如蛋白、mRNA、脂质等，可用作载体递送、功能化治疗以及疾病诊断[10-12]。目前有研究报道，可通过间充质干细胞对皮肤进行美白及抗衰老的相关修复。因此，外泌体在美白领域有着较大的应用潜力和优势[13]。牛奶是一种组成高度复杂的生物体液，含有大量具有生物活性分子的外泌体[14]。由于牛奶外泌体（mEXO）产量高，且可通过内体途径被动靶向至黑色素体内部，所以通过mEXO 对皮肤进行修复及美白成为了可能。本课题组前期通过噬菌体展示技术对外泌体表面高度表达的蛋白进行了筛选，获得一种新型的外泌体特异锚定肽CP05，通过该短肽可实现对外泌体的高效捕获、靶向及功能化修饰[15]。因此，本研究通过外泌体特异锚定肽CP05 将YRS 负载至mEXO 表面，在C57BL/6 小鼠模型上，系统探究该生物纳米制剂对酪氨酸酶活性以及黑色素生成的抑制作用，为进一步优化纳米制剂及提高抑制酪蛋白酶活性提供新的方法，从而为美白提供新的思路和治疗手段。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10 细胞、兔源CD63 多克隆抗体（美国，Santa Cruz公司）、HRP 标记羊抗兔抗体（美国，Sigma 公司）、HRP 标记兔抗羊抗体（美国，Sigma 公司）、微型滚针（中国，DRS Dermaroller 公司）、电镜铜网（中国，北京新兴百业公司）。

清洁级1～3 周的C57BL/6 健康雄鼠30 只，体重为6～15 g，购于南京模式动物研究所；清洁级6～8周的Nude BALB/c 健康雄鼠12 只，体重为18～20 g，购于南京模式动物研究所。

分光光度计Nanodrop2000c 核酸蛋白微量检测仪（美国，Thermo 公司）、Avanti J-26XP 超速离心机（德国，Beckman 公司）、HT7700 透射电子显微镜（日本，日立高新技术公司）。

1.2 mEXO 的分离和收集 选用生牛乳作为mEXO 的来源，将牛奶进行梯度离心（2 000×g 离心30 min，10 000×g 离心30 min）去除细胞碎片，将上清液通过0.22 μm 的滤器，去除杂质；再将滤液以100 000×g 离心70 min，弃去上清，用干净的100 μL的DPBS 反复吹打离心管底部，重悬得到mEXO。

1.3 醋酸铀染色及透射电镜观察mEXO 的形态及大小 将mEXO 重悬液加入到等体积的、质量分数为4%的多聚甲醛溶液中静置25 min；将铜网放在固定液上，室温固定25 min；用滤纸吸去多余的固定液，向铜网中滴加100 μL 1%戊二醛溶液，室温孵育5 min；吸去戊二醛溶液，加入100 μL 去离子水洗涤铜网，每次洗涤2 min，洗涤8 次；向铜网滴加100 μL 草酸铀溶液染色5 min；吸去多余草酸铀，向铜网上滴加100 μL 甲基纤维素-乙酸双氧铀溶液，放置冰上染色7 min；吸去铜网上多余的甲基纤维素-乙酸双氧铀溶液，并将铜网置于滤纸上风干，透射电镜观察。

1.4 Western 印迹检测mEXO 标志性蛋白（CD63、CD81）的表达 吸取等质量（20 μg）mEXO 样品和负载了YRS 的mEXO 于两个样品管中制样，依次进行电泳、转膜、孵育一抗鼠源CD63 单克隆抗体、一抗鼠源CD81 单克隆抗体，4℃摇床孵育10 h；以质量分数5%的脱脂牛奶洗一抗；孵育HRP 标记的羊抗兔二抗或兔抗羊二抗，4℃摇床孵育2 h；用含有体积分数为5%吐温-20 的PBS 洗二抗；最后向PVDF 膜滴200 μL 发光液（发光液A 和B 等体积混合均匀），暗室曝光。

1.5 流式细胞分析仪检测mEXO 中YRS 的负载效率 将mEXO、mEXO 和YRS、mEXO 和CP05修饰的YRS 各吸取20 μL，加入到200 μL 的PBS 中，通过流式细胞分析仪检测其负载YRS 的效率。

1.6 通过外泌体锚定肽CP05 将YRS 负载至mEXO 本课题组前期采用噬菌体库筛选出与外泌体表面的CD63 蛋白特异结合的锚定肽CP05（CRHSQMTVTSRL）[15]。将外泌体锚定肽CP05 通过连接肽G4S（GGGGS）与YRS（YRSRKYSSWY）连接，经生物公司在体外合成YRS-CP05 功能短肽（YRSRKYSSWYGGGGSCRHSQMTVTSRL）。并通过DIR 荧光染料标记mEXO，将标记好的mEXO 与YRS-CP05 短肽或YRS 裸肽（无菌的PBS 溶解）按照质量比1∶2 的比例置于4℃摇床孵育6 h。

1.7 黑色素瘤细胞摄取YRS、mEXO 以及mEXOYRS，观察与酪氨酸酶的共定位情况 在黑色素细胞中分别加入mEXO（50 μg）、YRS（50 μg）以及mEXOYRS（50 μg mEXO+50 μg YRS），并将培养基换成无FBS 的培养基，同时加入2%的双抗，37℃的培养箱中过夜，第2 天将上清弃去并用PBS 清洗3次，4%的多聚甲醛室温固定30 min，之后将黑色素细胞固定至加入DAPI 的盖玻片上，避光固定4 h 后，通过共聚焦显微镜观察细胞摄取效率。

1.8 黑色素瘤细胞摄取YRS、mEXO 以及mEXOYRS，观察不同时间点黑色素表达 将每皿黑色素细胞定量在1x106个，随机分为4 组：PBS 缓冲溶液治疗组（Untreated）、mEXO 单独治疗组（mEXO）、YRS 单独治疗组（YRS）、mEXOYRS治疗组（mEXOYRS），每组3 皿，各组YRS 给药剂量为50 μg，并将培养基换成无FBS 的培养基，同时加入2%的双抗，37℃的培养箱中过夜，分别处理1 周（1W）、2 周（2W）、6周（6W），处理结束后将上清弃去并用PBS 清洗3次，4%的多聚甲醛室温固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min，之后通过共聚焦显微镜观察各处理组在不同时间点的黑色素表达情况。

1.9 免疫荧光染色 在黑色素细胞中分别加入mEXO（50μg）、YRS（50μg）以及mEXOYRS（50 μg mEXO+50μg YRS），并将培养基换成无FBS 的培养基，同时加入2%的双抗，37℃的培养箱中过夜，第2 天将上清弃去并用PBS 清洗3 次，4%的多聚甲醛室温固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min，用0.2%～0.5%tritonX-100 对细胞透化处理10 min，之后利用2% BSA 封闭30 min，依次加入一抗、二抗，最后加入0.5 μg/mL DAPI 染色后，加入20 μL封片剂。

1.10 YRS、mEXO 以及mEXOYRS对于Nude BALB/c小鼠黑色素皮下瘤裸鼠模型的美白 通过对Nude BALB/c 小鼠进行皮下注射黑色素瘤细胞（1×106），接种后7 d 开始治疗。将荷瘤Nude BALB/c 小鼠随机分成4 组：PBS 缓冲溶液治疗组（Untreated）、mEXO 单独治疗组（mEXO）、YRS 单独治疗组（YRS）、mEXOYRS治疗组（mEXOYRS），每组3 只，各组YRS 给药剂量为50 μg，每日涂抹皮下瘤位置，涂抹2 周后对涂抹区域的皮肤进行HE 染色并定量分析。

1.11 YRS、mEXO 以及mEXOYRS 对于C57BL/6小鼠的美白 对C57BL/6 小鼠随机分成4 组：PBS缓冲溶液治疗组（Untreated）、mEXO 单独治疗组（mEXO）、YRS 单独治疗组（YRS）、mEXOYRS治疗组（mEXOYRS），每组3 只，各组YRS 给药剂量为50 μg，每日涂抹至1 周龄的C57 小鼠背部，涂抹3 周，之后对各处理组小鼠背部涂抹区域的皮肤进行石蜡切片并在镜下观察。

1.12 统计学处理 使用SPSS16.0 进行统计分析，正态分布的计量数据用±s 表示，多组间比较进行单因素ANOVA 方差分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 mEXOYRS表征及负载效率的验证 与mEXO相比，mEXO 负载YRS 后，具有相同的清晰的双层膜结构，负载YRS 并不影响mEXO 的形态结构（图1A），外泌体标志性蛋白CD63、CD81 与mEXO有同样的表达丰度（图1B）。在流式细胞分析结果中，YRS 通过外泌体锚定肽CP05 的负载效率达到了93.3%，而单独YRS 与mEXO 的负载效率为0.058%（图1C）。

图1 负载酪氨酸酶抑制肽（YRS）的牛奶外泌体（mEXO）表征及YRS 的装载效率Fig 1 Characterization of mEXO loaded with YRS and loading efficiency of YRS

2.2 黑色素瘤细胞高效摄取mEXOYRS并抑制黑色素的产生 为检测mEXO 能否促进黑色素瘤细胞对YRS 摄取，共聚焦显微镜检测YRS 与黑色素瘤细胞中酪氨酸酶的定位情况，结果显示，mEXOYRS被细胞的摄取量明显高于游离的YRS 肽，且通过mEXO的内体转运途径能提高YRS 与酪氨酸酶的共定位效率（图2A）。在1、2、6 周时间点，mEXOYRS处理的细胞中黑色素的含量与YRS 处理的细胞中黑色素含量比值分别为1.97、3.84、5.08（图2B），mEXOYRS对B16-F10 细胞黑色素合成的抑制能力显著强于游离的YRS 短肽。定量分析结果显示：mEXOYRS组相比于YRS 组，在第1 周、第2 周、第6 周时，细胞中黑色素含量均显著下降（F=56.117、48.954、560.006，均P＜0.05）（图2C）。

图2 mEXOYRS 的细胞摄取效率及抑制黑色素生成效率Fig 2 Cell uptake efficiency and inhibition efficiency of melanin production of mEXOYRS

2.3 在Nude BALB/c 小鼠黑色素细胞皮下瘤模型中mEXOYRS抑制色素沉积 与Untreated 相比，YRS及mEXOYRS 均可减少黑色素瘤中黑色素的表达，且mEXOYRS 相比于YRS 呈现出更强的抑制黑色素表达的能力（图3A）。病理结果显示，YRS 及mEXOYRS均可减少黑色素瘤的着色，且mEXOYRS呈现出更强的减少黑色素瘤着色的能力（图3B）。2.4 mEXOYRS在C57BL/6 小鼠皮肤上具有美白功能 mEXOYRS处理的小鼠的皮肤相比于其他处理组，有更少的黑色素沉积（图4A）。同样病理结果显示，mEXOYRS组中毛囊色素沉积相比于其他处理组更少（图4B），定量结果表明（图4C），与mEXO 组相比，YRS 组与mEXOYRS组均显著减少了黑色素含量（F=173.083，P＜0.05）并显著抑制了酪氨酸酶活性（F=34.156，P＜0.05）。

图3 mEXOYRS 抑制黑色素皮下瘤模型中黑色素产生Fig 3 The melanin production in a melanoma subcutaneous tumor model inhibited by mEXOYRS

图4 mEXOYRS 对C57BL/6 小鼠皮肤美白效果验证Fig 4 Verification of skin-whitening effect of mEXOYRS on C57BL/6 mice

3 讨论

皮肤色素沉着是由于黑色素体产生黑色素导致的，而黑色素的产生与黑色素体的酪氨酸酶活性有关，在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化成多巴醌，多巴醌会自动氧化为多巴色素，最后在半胱氨酸的条件下生成黑色素[16]。近期有报道指出，通过抑制黑色素体的酪氨酸酶活性，是减少黑色素产生，改善皮肤色素沉积的有效方法[17]。现阶段熊果苷及对苯二酚可有效抑制酪氨酸酶活性，但其在抑制酪氨酸酶活性的同时也会产生不良反应，根据报道，酪氨酸酶抑制肽具有低毒性[18]。本研究以期通过酪氨酸酶抑制肽实现抑制酪氨酸酶活性和缓解不良反应的目的。但本研究发现单独的酪氨酸酶抑制肽YRS 被黑色素瘤细胞摄取效率低，且与黑色素体内酪氨酸酶共定位作用弱。因此，迫切需要一种新型制剂，提高YRS 与酪氨酸酶共定位效率，增强YRS抑制黑色素产生的效果。

mEXO 作为一种天然的纳米级生物小囊泡，其富含抑制黑色素生成的microRNA[19]，并且由于其独特的生物学特性，可作为理想的生物载体，通过内体转运途径，实现靶向黑色素体内酪氨酸酶的目的。基于此，本研究利用本实验室自主研发的外泌体特性锚定肽CP05，成功将YRS 负载至mEXO 表面。之后参考抑制酪氨酸酶活性的相关研究[20]，本研究在黑色素瘤细胞中发现YRS 负载至mEXO 后，能够被细胞摄取，并与酪氨酸酶有良好的共定位效果，随着处理时间的延长，抑制黑色素的生成的效果越明显。本研究在Nude BALB/c 小鼠黑色素瘤皮下模型上也进行了验证，同样发现YRS 负载至mEXO 后能够有效抑制黑色素瘤的色素沉积。黑色素体处于皮肤的基底层，常规的酪氨酸酶抑制剂较难通过皮肤的角质层，并难以被黑色素细胞摄取[21]。为了更贴合实际，本研究在C57BL/6 小鼠皮肤上进行了验证，结果发现YRS 负载至mEXO 后对小鼠皮肤具有美白的作用。

综上所述，本研究通过mEXO 负载YRS，依靠内体转运的方式将YRS 被动靶向至酪氨酸酶，有效抑制了黑色素的生成，降低了皮肤色素沉积，显著对皮肤实现美白的目的。后续研究中，笔者将寻求志愿者，在人群中评估该制剂的有效性，为其商品化应用提供基础。