基于网络药理学及体内外实验研究连翘不同提取液抗RSV 作用

王 平，马元荣*，张会敏

（1.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；2.天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 300072；3.山东省济南市长清区平安街道社区卫生服务中心，山东 济南 250300）

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）隶属副黏液病毒科肺炎病毒属[1]，是诱发婴幼儿、老年人及免疫功能低下者呼吸道感染常见的RNA 病毒[2-3]。 感染发病率高，以不同程度的发热、咳嗽、咽痛及呼吸急促为常见临床症状[4]，若病情未得到及时有效的控制，极易发生哮喘、急性呼吸衰竭及心力衰竭，甚至死亡[5-8]。 临床对RSV 患者常给予利巴韦林、干扰素治疗[9]，但上述药物疗效有限，常出现发热、过敏等不良反应[10-11]。目前RSV 感染的流行趋势依旧严峻，至今尚无安全有效的疫苗和特效的防治方法。

中药防控病毒性感染有着数千年的临床实践经验[12]，除了直接杀灭病毒、抑制病毒复制、阻止病毒致细胞损伤外，还能减轻严重的炎症反应、加强机体对病毒的免疫应答，同时具有毒副作用少、药源丰富、价格低廉及抗毒谱广等优势[13-15]。 中药连翘为中医学中广泛应用的一种清热药，无毒，安全性高[16]。《中华人民共和国药典》记载，连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl 的干燥果实[17]。《本草图经》中记载，连翘味苦，性微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效，主要的药效物质为连翘酯苷、挥发油、连翘苷等[18]。 田文静等[19]发现连翘水提液抗RSV 活性存在明显的量效关系，而且在不同感染时间给药都能产生抑制作用。借助网络药理学系统地预测连翘抗RSV 的活性成分、潜在靶点、信号通路，并结合体内外实验对连翘不同提取液抗RSV 活性进行初步验证，获得在体内外都有较好抗RSV 效果的连翘提取物，为研发高效抗病毒单体奠定基础。

1 材料

1.1 主要的仪器设备

CKX41 型倒置显微镜（奥特光学仪器有限公司）；IL-161CT 型CO2培养箱（施都凯仪器设备有限公司）；SB5200DTS 型超声波双频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Allegla X-30R 型全能高速冷冻离心机（美国贝克库曼尔特有限公司）；TDL-5-A 型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药品及主要试剂

连翘经山东省中医药研究院生药教研室鉴定；利巴韦林（批号：J1202A，大连美仑生物技术有限公司）。

磷酸盐PBS 缓冲盐溶液（批号：0025018）、胎牛血清（批号：1842926）、2% DMEM 维持液（批号：0021019）均购自以色列Biological Industries 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（批号：20190430）、青霉素/链霉素混合液（批号：20181211）均购自北京索拉比奥科技有限公司； 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批号：20180715，天津市富宇精细化工有限公司）；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT）（批号：715F0522，北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 实验细胞与病毒

人肺癌细胞（A549）由山东省医学科学院基础所微生物室惠赠，于山东中医药大学病原微生物实验室传代后使用。

RSV 由山东省医学科学院基础所微生物室惠赠，-80 ℃保存于山东中医药大学病原微生物实验室。

1.4 实验动物

BALB/c 小鼠60 只，SPF 级，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号为SCXK（鲁）2019-0003。

2 方法

2.1 连翘抗RSV 的机制研究[20]

2.1.1 活性成分的筛选及成分靶点的收集 搜集TCMSP 数据库，以“连翘”为检索词，以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%且药物相似性（drug likeness, DL）≥0.18 为条件， 初步筛选出活性成分。

活性成分输入Open Babel 数据库，将其结构转化为SMILES，导入Swiss TargetPrediction 数据库，设置物种为“Homo sapiens”，移除非人源、不规矩及重复靶点，将数据库中靶点与化合物进行模拟对接，选取结果Probability＞0.5 的靶点建立数据库。

2.1.2 RSV 靶点预测及网络图构建 以“RSV”为关键词，在GeneCards、GenCLiP3 和NCBI 中搜索，删除重复靶点，建立RSV 靶点库。将活性成分-RSV 靶点导入Cytoscape 3.8.2，构建网络图。

2.1.3 富集分析 将连翘抗RSV 的作用靶点输入DAVID 6.8 数据库，进行GO 功能及KEGG 通路富集分析。

2.2 连翘不同提取液抗RSV 的体外实验研究

2.2.1 供试品制备 煎煮液：精密称取样品，加6 倍量水，回流提取2 h，滤过，得到浓度为2 g/mL 的溶液。 超声液：精密称取样品，加10 倍量水，超声处理30 min，滤过，得到浓度为2 g/mL 的溶液。 煎煮、超声离心液：吸取适量煎煮液及超声液，8000 r/min，离心10 min（离心半径18 cm）。 煎煮、超声过滤液：吸取适量煎煮液及超声液，用0.22 μm 滤膜过滤。利巴韦林溶液：精密称取利巴韦林粉末，用PBS 配制成最终浓度为4 mg/mL 的溶液。

2.2.2 A549 细胞的复苏和培养 将液氮罐内冻存的A549 细胞在37 ℃水浴锅内晃动1 min，使其快速融化。 1000 r/min 离心5 min（离心半径16 cm），弃掉上清液。 加适量的10% DMEM 培养液，反复吹匀，取适量悬液，转入培养瓶，补加培养液至12 mL。放置于37 ℃、5% CO2恒温培养，细胞长成单层后，加1 mL 0.25%的胰酶消化，1∶3 传代。

2.2.3 RSV 扩增和保存 RSV 接种于A549 单层细胞上，1 h 后，加入12 mL 含2%胎牛血清的DMEM维持液，恒温培养。 实时观察细胞病变情况，待细胞病变出现80%以上时，取出后离心，1000 r/min 离心5 min（离心半径16 cm），收集上清液，定量分装，-80 ℃保存，备用。

2.2.4 病毒毒力测定 病毒液用2% DMEM 维持液10 倍比稀释成8 个不同浓度梯度，依次接种在96 孔板内单层细胞上，纵向重复6 孔，设两列细胞对照。培养3 d，每日观察细胞病变情况。培养结束前4 h，弃废液。 加入10 μL MTT 和100 μL PBS，置于恒温培养箱4 h。 弃废液，加200 μL DMSO，490 nm 波长检测OD 值。 根据Reed-Muench 公式，计算病毒液半数感染剂量（TCID50）。

2.2.5 细胞毒性测定 连翘不同提取液用2%DMEM 维持液从原始浓度开始2 倍比稀释成10 个梯度；分别接种于96 孔板内，接种量为50 μL/孔，重复4 孔，同设2 列空白对照；于37 ℃、5% CO2恒温培养，每日观察细胞病变情况，持续3 d。 弃掉废液，加100 μL PBS 和10 μL MTT，培养箱内培养4 h；弃上清染液，加200 μL DMSO，490 nm 测定OD值，采用Reed-Muench 方法计算药物半数毒性浓度（TC50）。

2.2.6 抗RSV 毒性测定[21]将配比好的连翘不同提取液及阳性药利巴韦林横向接种，50 μL/孔，重复4孔；除空白对照外，每孔接种50 μL 病毒液；每日观察细胞病变情况，3 d 后，加入100 μL PBS 和10 μL MTT，培养箱内培养4 h；弃染液，加200 μL DMSO，490 nm 波长检测OD 值。 用Reed-Muench 方法计算半数有效浓度（EC50）及治疗指数（TI）。

2.3 连翘煎煮离心液抗RSV 的体内实验研究

小鼠每侧鼻腔内滴入35 μL 病毒液（100 个TCID50），正常组小鼠滴入等量的DMEM 维持液[22]，待小鼠完全吸入后放入笼中继续观察，连续滴鼻3 d，1 次/d[23]。

滴鼻3 h 后，观察小鼠是否死亡，并灌胃给药0.2 mL/15 g，1 次/d，正常组和模型组给予等体积的生理盐水[21]。 连续灌胃5 d，期间观察并记录小鼠的精神、活动、饮食等情况。

2.3.2 血常规测定 眼眶取血，血液滴入加有EDTA-2K 的EP 管，检测白细胞（white blood cell,WBC）、淋巴细胞（lymphocyte count,LYM）、单核细胞（mononcyte, MON）、中性粒细胞（neutrophil, NEU）计数。

2.3.3 肺指数测定 取血结束后，脱颈法处死小鼠，摘取完整肺组织并称重，计算出肺指数。肺指数=肺质量/体质量。随后将肺组织处理，进行病理学检测。

2.3.4 病理观察 取相同大小同一位置的左肺，制备石蜡切片行HE 染色，显微镜观察肺部病变情况并拍照记录。

2.3.5 肺组织免疫组化检测 石蜡切片行DAB 染色，脱水封片，置于显微镜下镜检，计算平均光密度值。

2.3.6 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料用“±s”表示。多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 连翘抗RSV 的机制研究

筛选出21 个活性成分，抗RSV 潜在作用靶点129 个，详见图1。 GO 分析得到548 个条目，连翘参与的生物过程主要有基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、药物的反应、DNA 模板转录的正向调节等；在细胞成分中，主要涉及胞质溶胶、质膜部分等；分子功能主要包括酶结合、转录因子结合等，详见图2。 KEGG 分析筛选出作用通路共112 条，有癌症通路、癌症中的蛋白多糖、乙型肝炎、HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路等相关通路，详见图3。

图1 连翘抗RSV 靶点网络图

图2 GO 富集分析图

图3 KEGG 信号通路分析图

3.2 连翘不同提取液抗RSV 的体外实验研究

3.2.1 RSV 半数感染剂量（TCID50） 培养72 h，根据病毒所致A549 细胞病变情况， 计算出RSV 的TCID50为10-3.77。

3.2.2 连翘不同提取液对RSV 的抑制作用 体外连翘不同提取液抗RSV 效果：煎煮离心液＞超声离心液，超声液、煎煮液较前两者略差。 详见表1。

表1 连翘不同提取液对细胞的毒性和抗RSV 活性

3.3 连翘煎煮离心液抗RSV 的体内实验研究

3.3.1 各组小鼠血常规水平比较 与正常组相比，模型组WBC、LYM、MON 计数升高，NEU 计数下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，利巴韦林组、高剂量组、中剂量组、低剂量组WBC、LYM、MON 计数明显下降，NEU 计数升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与利巴韦林组相比，中剂量组、低剂量组WBC、LYM、MON 计数升高，NEU 计数下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），高剂量组WBC、LYM 计数升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与高剂量组相比，低剂量组WBC、LYM 计数升高，NEU 计数下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 详见表2。

表2 各组小鼠血常规检测结果(±s，n=10)

表2 各组小鼠血常规检测结果(±s，n=10)

注：与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与利巴韦林组相比，△P＜0.05；与高剂量组相比，▽P＜0.05。

组别正常组模型组利巴韦林组高剂量组中剂量组低剂量组WBC/（×109·L-1）2.31±0.02 2.42±0.02*2.32±0.01#2.34±0.01*#△2.35±0.01*#△2.36±0.01*#△▽LYM/（×109·L-1）1.39±0.01 1.62±0.02*1.40±0.02#1.42±0.01*#△1.43±0.01*#△1.44±0.01*#△▽NEU/（×109·L-1）0.80±0.02 0.60±0.02*0.80±0.01#0.79±0.01#0.76±0.02#*△0.71±0.03#*△▽MON/（×109·L-1）0.04±0.01 0.06±0.01*0.04±0.01#0.04±0.01*#0.05±0.01*#△0.05±0.01*#△

3.3.2 各组小鼠肺指数比较 与正常组相比，模型组肺指数升高（P＜0.05），说明造模成功。与模型组相比，利巴韦林组、高剂量组、中剂量组、低剂量组肺指数下降（P＜0.05）；与利巴韦林组相比，高剂量组、中剂量组、低剂量组肺指数升高（P＜0.05）；与高剂量组相比，中剂量组、低剂量组肺指数升高（P＜0.05）。 详见表3。

表3 各组小鼠肺指数的结果（±s，n=10)

表3 各组小鼠肺指数的结果（±s，n=10)

注：与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与利巴韦林组相比，△P＜0.05；与高剂量组相比，▽P＜0.05。

组别正常组模型组利巴韦林组高剂量组中剂量组低剂量组肺指数/%0.66±0.03 1.37±0.02*0.86±0.02*#0.89±0.02*#△1.07±0.04*#△▽1.14±0.02*#△▽

3.3.3 各组小鼠感染RSV 后肺组织的病理变化 正常组肺泡腔大小正常，泡壁完整、未见明显炎性细胞浸润，管腔无分泌物；模型组小鼠肺组织增生，间质内出现大量炎性细胞且分布均匀，支气管上皮增生、脱落，支气管周围慢性炎性细胞浸润，肺动脉上皮增生显著；利巴韦林组小鼠个别支气管上皮轻度增生，肺泡大致正常；高剂量组小鼠个别支气管上皮轻度增生、脱落，肺泡间质轻度增生；中剂量组小鼠支气管周围轻度慢性炎性细胞浸润，部分上皮组织增生，间质部分肺泡充血；低剂量组小鼠肺泡壁增厚，支气管上皮细胞增生，脱落至管腔，间质细胞增生，肺泡腔可见充血，慢性炎性细胞浸润较明显。 详见图4。

图4 各组小鼠肺组织HE 染色结果图（×200）

3.3.4 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK表达比较 与正常组相比，模型组的TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK 平均光密度值升高（P＜0.05），肺组织出现大量阳性细胞染色；与模型组相比，利巴韦林组、高剂量组TLR4、NF-κB p65 及p38 MAPK 平均光密度值下降（P＜0.05），中剂量组TLR4、p38 MAPK平均光密度值下降（P＜0.05）；与利巴韦林组相比，中剂量组、低剂量组NF-κB p65 平均光密度值升高（P＜0.05）；与高剂量组相比，中剂量组、低剂量组NF-κB p65 平均光密度值升高（P＜0.05）。详见表4，图5-7。

图5 各组小鼠肺组织TLR4 的免疫组化染色图（×200）

表4 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK 的平均光密度值比较（±s，n=18)

表4 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK 的平均光密度值比较（±s，n=18)

注：与正常组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05；与利巴韦林组相比，△P＜0.05；与高剂量组相比，▽P＜0.05。

组别正常组模型组利巴韦林组高剂量组中剂量组低剂量组NF-κB p65 0.060±0.011 0.073±0.014*0.062±0.008#0.064±0.007#0.071±0.016*△▽0.072±0.010*△▽TLR4 0.056±0.004 0.062±0.006*0.056±0.004#0.055±0.004#0.057±0.007#0.058±0.010 p38 MAPK 0.052±0.006 0.116±0.184*0.049±0.004#0.048±0.004#0.055±0.013#0.067±0.009

4 讨论

连翘是临床常用清热解毒药，目前研究较为充分的是连翘的不同化学成分抗病毒活性，但其抗病毒机制的研究却相对缺乏。本研究利用网络药理学的方法对连翘抗RSV 的活性成分、作用靶点、相关通路等进行了探讨，筛选出槲皮素、连翘苷、木犀草素等21 个活性成分，129 个抗RSV 靶点，富集548个生物过程及112 条信号通路。结果表明连翘多成分协同影响宿主自身IL-1B、IL-2、IL-6 等细胞因子水平，干预HIF-1、TNF 等信号通路，从而发挥抗RSV作用[24-25]。 借助网络药理学的方法证实连翘通过多成分、多靶点、多通路发挥抗RSV 作用，但其方法预测药效机制有局限性。此外，本研究通过体外细胞实验和体内动物实验验证了其抗RSV 的活性。

图6 各组小鼠肺组织NF-κB p65 的免疫组化染色图（×200）

图7 各组小鼠肺组织p38 MAPK 的免疫组化染色图（×200）

在体外细胞水平上进行连翘抗RSV 作用的验证，用预防给药的方法证明连翘不同提取液对RSV病毒有杀灭作用。 但其不同方法的提取液抗RSV 的效果差异较大，提示煎煮液经离心或过滤后，毒性杂质减少，活性成分的组成及含量增加。

体内实验从血常规、肺指数检测、HE 染色方面研究连翘煎煮离心液对RSV 感染后的小鼠的影响，证实中剂量组、高剂量组对RSV 引起的肺炎具有较好的调节作用。 TLR4 是与RSV 感染的密切受体之一，可通过识别病毒的F 蛋白和细胞表面脂多糖，激活下游的p38 MAPK 和NF-κB[26-27]。 干预调控TLR4，可使得下游NF-κB p65 引发的炎性因子表达受阻，缓解RSV 引起的肺部病理损伤。 免疫组化结果推测连翘煎煮离心液可通过调动宿主免疫系统的功能，产生大量的免疫因子来阻止病毒的复制、繁殖，达到抗病毒的效果。 RSV 感染者外周血T 淋巴细胞亚群及Th1、Th2 细胞因子呈现异常表达[28]，课题组可进一步研究连翘高剂量给药能否恢复RSV肺炎小鼠体内CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10 水平，从而发挥抗RSV 作用。