基于网络药理学及分子对接探讨熟地黄-山茱萸药对治疗阿尔茨海默病的潜在机制

张 卓，时 晶*，魏明清，李 婷，侯敏哲，徐江林

（北京中医药大学东直门医院，北京 100029）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，是痴呆症最常见的病因。痴呆的主要临床特征是日常生活能力下降、行为异常和认知功能障碍。 目前，该病发病率越来越高，其发病机制尚未明确，这不仅是患者及其家属面临的难题，也是整个社会关注的全球公共卫生问题。 调查估计，全球目前有超过5000 万痴呆症患者[1]。2050 年，全球新发AD 病例预计将达到1 亿例[2]。 因此，AD 的防治是一个世界性亟待解决的问题。 目前，针对β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein, Aβ）和tau 蛋白治疗AD 的疗效并不令人满意，临床用药如多奈哌齐和美金刚的疗效有限，毒副作用较明显，且各种新药的研发也遇到瓶颈。 因此，有必要从多靶点的角度研究AD 的治疗。

中医药治疗AD 的优势在于能够改善并使患者认知功能维持更长时间，更能够针对一些西医难以解决的躯体症状（如幻觉、妄想、错认、抑郁等痴呆行为和食欲不振、失眠、便秘等精神症状），对肝、肾、胃肠道等脏器的毒副作用较西药少，且可通过多靶点、多种途径对疾病产生作用。 因此，中医药已成为近年来治疗AD 的研究热点。 中医药治疗AD 以补肾虚为本，即治法以“补肾填髓健脑”为主。 有研究显示，通过药物关联规则分析，治疗AD 的补肾中药中，关联最强的药对是熟地黄-山茱萸[3]。 熟地黄生精填髓，为补肾阴之要药；山茱萸滋补肝肾。 从补肾益髓理论治疗老年痴呆的常用药对中，熟地黄-山茱萸的出现频率极高[4]。熟地黄和山茱萸已被证明对神经系统具有一定的保护活性[5]。 熟地黄的有效成分梓醇可通过减弱乙酰胆碱酯酶活性以保护胆碱能系统，对AD 发挥治疗作用[6]，还可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活从而减弱Aβ 的神经毒性[7]。山茱萸已被证明可通过增强记忆或认知来改善痴呆，已被广泛用作增强记忆或认知的药物[8]，其有效成分山茱萸多糖能够改善AD 模型大鼠的学习和记忆能力[9]，另一有效成分山茱萸环烯醚萜苷可通过降低tau 蛋白过度磷酸化及沉积来治疗AD[10]。 以上研究表明，熟地黄-山茱萸药对在治疗AD 中可能发挥关键的作用。

网络药理学作为传统药理学、分子生物学、生物信息学等学科交叉的产物，突破了传统的单靶点、单通路药物研究的概念，其整体性、系统性特征与中医整体观、辨证论治原则、方剂配伍原则相吻合。 通过网络药理学对中药药效物质、药理作用的研究及中药新药的研发具有重要意义，同时也为阐释方剂配伍的科学内涵及中医药的现代化研究奠定了理论基础[11]。 分子对接技术可以模拟预测出小分子配体与受体化合物间相互作用的机制[12]。 网络药理学及分子对接技术对药物的研发和疾病的病理机制研究也具有重要价值[13]。

本课题组前期研究已经提出，补肾疗法应贯穿治疗AD 过程的始终[14]。 由于熟地黄或山茱萸单味药物治疗AD 的机制研究较多，而两药配伍对AD的作用机制的研究尚少，且AD 的发病机制目前尚未明确，故本研究旨在运用网络药理学方法和分子对接技术，筛选熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的主要物质基础、核心作用靶点，从而探索其潜在机制，为进一步的体内外研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 熟地黄-山茱萸药对活性成分的筛选及靶点预测

在中药系统药理学分析平台（TCMSP, http://tcmspw.com/）中检索熟地黄和山茱萸，收集两种中药的活性成分。 吸收-分布-代谢-排泄（absorptiondistribution-metabolism-excretion, ADME）筛选模型是利用一系列吸收、分布、代谢和排泄等相关的药代动力学参数筛选中药数据库中主要有效成分的有效模型[15]。 以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）、药物相似性（drug-likeness, DL）和血脑屏障（blood brain barrier, BBB）为3 个评价参数，根据TCMSP数据库推荐的标准，筛选出OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3的潜在作用的活性化合物。

在TCMID 数据库（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）中搜索熟地黄和山茱萸，将查到的活性成分化合物名称输入PubChem 数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)搜索，得到化合物2D 结构的SDF 文件，导入SwissADME 数据库（http://www.swissadme.ch/）后根据以下条件筛选出潜在作用的活性化合物：（1）药代动力学中胃肠道（Gastrointestinal, GI）吸收为“High”，用于筛选具有较好OB 的活性化合物；（2）药代动力学中BBB 渗透为“Yes”，由于本研究的AD 是中枢神经疾病，所以筛选出的活性化合物必须能通过BBB；（3）药物相似性中的前5 项即Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge，其中至少有两项为“Yes”则可作为药物的潜在作用化合物[16]。同时，通过检索文献进行补充。 有些化合物虽不符合以上标准，但为了使网络药理学分析结果更加准确可信，应将文献检索得到的对神经元功能有重要作用的化合物也列为潜在作用化合物。例如，松果菊苷[17]可通过促进乙酰胆碱的合成和对海马神经元的保护，改善认知功能障碍；毛蕊花糖苷[18]通过降低NO 含量、NO 合酶活性和Caspase-3 蛋白表达来改善AD 症状；梓醇[19-20]能增强胆碱乙酰转移酶的活性，显著提高神经元存活率和轴突长度，同时还可增加Aβ 诱导的神经退行性变小鼠前脑神经元中脑源性神经影响因子的表达，从而改善小鼠记忆力下降的症状。 栀子苷可通过调节线粒体相关蛋白途径以提高APP/PS1 小鼠的探索和记忆能力，有效改善认知障碍[21]，还可下调mTOR 信号以增强Aβ 的自噬和溶酶体清除治疗AD[22]。

分别将两种中药在以上两个数据库筛选及文献检索得到的潜在作用化合物导入SwissTargetPrediction 平台（http：//www.swisstargetprediction.ch/），根据已知化合物的2D 或3D 结构预测化合物靶点[23]，以属性为“智人（homo sapiens）”且概率值≥0 为预测靶点的设置标准。 将所有得到的靶点合并后去掉重复值，最终得到中药药对的作用靶点。

1.2 阿尔茨海默病相关靶点筛选

通过DisGeNET 基因-疾病关联数据库(https://www.disgenet.org/）和GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）筛选AD 相关靶点基因。 以“Alzheimer's disease”作为关键词，从以上两个数据库中搜索。 在GeneCards 数据库中，相关性得分越高，靶点与疾病的关系就越密切。根据经验，如果检索得到的靶点太多，则将相关性得分大于中位数的靶点作为潜在靶点。 将两个数据库中得到的的靶点合并，删除重复值，得到AD 的相关靶点。

1.3 AD 与熟地黄-山茱萸药对的共同靶点PPI 网络构建

为了获得本研究药对治疗AD 的潜在作用靶点，将AD 相关的靶蛋白与中药药对的作用靶点取交集，通过微生信在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn）绘制的韦恩图对交集靶点进行可视化。然后将交集靶点导入STRING 网站（https://stringdb.org/），以建立PPI 网络，用于随后的拓扑特性分析以确定治疗AD 的中枢靶点，选择置信度最高（低：＜0.4；中等：0.4～0.7；高：＞0.7；最高：＞0.9）。

度（Degree）[24]、中介中心度（betweenness centrality, BC）[25]和接近中心度（closeness centrality, CC）是评估网络中节点中心属性的常用拓扑参数。 这些参数值越高，节点在网络中越重要。 利用Cytoscape 3.7.2 软件（http://www.cytoscape.org）的CytoNCA 插件计算交集靶点的参数，然后筛选交集靶点中的关键靶点。 筛选参数第一步为：度≥二倍中位数；第二步筛选参数为:度≥中位数，BC≥中位数，CC≥中位数。筛选出的关键靶基因用于进一步的分子对接研究。

1.4 药对的潜在靶点-关键成分-中药PPI 网络构建

根据取交集后得到的熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在作用靶点，对所有潜在作用化合物进行筛选，得到与潜在作用靶点关联的化合物作为关键成分。 使用Cytoscape 3.7.2 软件将潜在靶点-关键成分-中药网络可视化。

1.5 潜在靶点的GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

Metascape 平台（http://metascape.org/gp/index.html）[26]是一个旨在提供全面的基因列表注释和分析资源的门户网站，它结合了功能富集、互作组分析、基因注释和成员搜索。 将潜在作用靶点导入Metascape 平台，物种设置为“智人（homo sapiens）”，进行基因本体（gene ontology, GO）生物过程富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）富集分析[27]，修正的Fisher精确P 值越小，富集程度越高。 保存数据后利用微生信在线平台绘制柱状图和气泡图，对数据进行可视化。

1.6 中药-相关关键成分-关键靶点-通路的网络构建

根据KEGG 富集分析中富集程度前10 通路中富集的关键靶点，筛选相关关键成分及中药进行数据处理，利用Cytoscape 3.7.2 软件绘制“中药-相关关键成分-关键靶点-通路”网络图，集中展示熟地黄-山茱萸药对关键成分的作用靶点与前10 通路的相互作用关系。

1.7 药对关键核心成分-核心靶点分子对接

在UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）中搜索关键靶点基因编码的受体蛋白。 在RCSBPDB 蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）[28]下载蛋白质的3D 结构。 从PubChem 数据库[29]下载分子配体的2D结构，受体蛋白的脱水用PyMOL 2.4.0 软件（https://pymol.org/）进行，蛋白质的氢化用AutoDock Tools软件（http://mgltools.scripps.edu/downloads）进行。 将小分子配体结合的活性口袋位点作为受体-蛋白质对接位点的参数。最后使用AutoDock Vina 软件（http://vina.scripps.edu/download.html）[30]将受体蛋白与药对主要关键成分的小分子配体对接。

2 结果

2.1 熟地黄-山茱萸药对活性成分的筛选及靶点预测

从TCMSP 和TCMID 数据库中检索，经OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3 和SwissADME 筛选及文献检索，山茱萸共有36 个活性成分，熟地黄共有3 个活性成分。 由于筛选所得熟地黄的3 种成分在多种中药中普遍存在，特异性低，所以本研究通过检索中国知网补充熟地黄的活性化合物。 通过上述方法得到熟地黄-山茱萸药对的潜在活性化合物共36 个，见表1。 两药有2 个共有成分，通过SwissTargetPrediction 平台预测活性成分的对应靶点共有718 个。

2.2 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点

通过DisGeNET 和GeneCards 两个数据库筛选得到AD 疾病靶点共450 个。 将预测得到的药对活性成分靶点与筛选出的AD 疾病靶点取交集，得到120 个熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点。 详见图1。

图1 熟地黄-山茱萸药对活性成分靶点与AD 共同靶点韦恩图

2.3 潜在靶点PPI 网络构建

将以上潜在靶点导入STRING 数据库中，选择最高置信度分数（即0.9），得到描述了它们之间的PPI网络，如图2 所示。 利用Cytoscape 3.7.2 软件的CytoNCA 插件计算交集靶点的拓扑参数，筛选交集靶点中的关键靶点，参数设置如下。 第一步筛选参数值为:度值≥46；第二步筛选参数为：度值≥63，BC≥0.025 279 23，CC≥0.676 267 735。 最终得到了7 个关键靶点，按照度值从大到小分别为AKT1、MAPK3、CASP3、TNF、TP53、VEGFA、MAPK1，详见图3 及表2。

表2 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的7 个关键靶点相关信息

图2 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 潜在靶点的PPI 网络图

图3 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 核心靶点

2.4 药对的潜在靶点-关键成分-中药PPI 网络

根据熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点，对所有活性成分进行筛选，得到与潜在作用靶点关联的36 个成分作为关键成分，用软件的Network Analyzer 功能分析网络的拓扑参数，筛选出度值较大的前10 个成分作为关键核心成分，详见表1。 通过Cytoscape 3.7.2 软件完成潜在靶点-关键成分-中药网络，详见图4。

图4 熟地黄-山茱萸药对的潜在靶点-关键成分-中药PPI 网络图

表1 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的关键成分相关信息

2.5 潜在靶点的GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

GO 富集分析由生物过程（biological process,BP）、细胞成分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）组成。应用Metascape 数据平台对熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点进行GO 富集分析，根据命中基因计数和P 值的大小选择每个富集结果的前10 条（见图5）。 BP 方面，潜在靶点主要富集在配体依赖性的Notch 受体加工、生物碱代谢过程以及多巴胺分解代谢过程等；涉及的CC 主要有γ-分泌酶复合物、突触前细胞质、突触前膜的组成成分、突触前膜固有成分、树突轴、膜小凹及富含ficolin-1 颗粒腔等；影响的MF 包括半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路、MAPK 激酶活性、MAPK 活性、乙酰胆碱结合、动力蛋白激活蛋白的结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡的执行期等。

图5 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点GO 富集分析

同样应用Metascape 数据平台对熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点进行KEGG 通路富集分析，筛选度值前20 的通路，运用富集气泡图展示，如图6，主要参与的通路包括AD、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、细胞坏死性凋亡等。

图6 熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的潜在靶点KEGG 通路富集分析（前20 项）

2.6 中药-相关关键成分-核心靶点-通路网络构建

筛选出与前10 通路相关的靶点共82 个，其中包含先前筛选出的7 个核心靶点，关键成分共30个，利用Cytoscape 3.7.2 软件绘制“中药-相关关键成分-关键靶点-通路”网络（见图7），用Cytoscape 3.7.2 软件的Network Analyzer 功能分析网络的拓扑参数。 结果30 个关键成分中有25 个度值＞5，约占83%，且先前潜在靶点-关键成分-中药PPI 网络中筛选出的10 个关键核心成分均在其中。 这表明绝大多数的关键成分是通过作用于多个靶点发挥作用的，体现了中药的多靶点药效特点。

图7 中药-相关关键成分-关键靶点-通路网络图

2.7 药对关键核心成分-核心靶点分子对接

利用分子对接技术研究核心靶点基因与熟地黄-山茱萸药对关键成分之间可能的相互作用。 共进行了70 次对接模拟（见表3）。AutoDock 和AutoDock Vina 的评分函数规定，当对接亲和力值＜0 时，配体和受体分子能稳定结合，绝对值越大，化合物与核心靶点活性部位的结合稳定性越强。 根据对接结果，大多数结合复合物具有较高的结合亲和力，平均结合亲和力为-7.4 kcal/mol。 此外，每个目标配体与活性化合物残基之间至少有一个氢键形成。 大多数氢键相互作用被认为是强相互作用，平均距离为2.7Å。9 对分子对接模型及其相互作用的氢键如图8所示。 总的来说，分子对接表明所有熟地黄-山茱萸药对的活性化合物都能较容易地进入并结合核心靶点的活性口袋。

图8 核心靶点与关键成分分子对接模式图及对接能热图

表3 核心靶点与关键核心成分的分子对接结果

续表3

3 讨论

中医药治疗AD 的历史可以追溯到几千年前的《左传》，有关其论述大多记载于“痴呆、呆病、健忘”等相关文献中。 肾藏精，精生髓，脑由髓聚而成，正如《素问·五藏生成》载“诸髓者,皆属于脑”。 脑为髓海，元神之府，神机之用。 人的记忆、学习、语言等认知功能是以脑髓为物质基础，与肾精的充足与否有密切关系。唐容川在《中西汇通医经精义·五脏所藏》中说：“事物之所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾精。 ”《医学心悟·健忘》也明确指出：“肾主智，肾虚则智不足。 ”因此，肾精充足，髓海得养，则思维敏捷，精力充沛，认知功能正常；若肾精不足，髓海空虚，脑失所养，则见“脑转耳鸣，胫痠眩冒，目无所见，懈怠安卧”，认知功能障碍。 来源天然、多靶点、辨证论治和整体观念等中医药的独特优势，在治疗复杂疾病尤其是使用西药效果欠佳且毒副作用明显的疾病方面是显而易见的。近年来，中医药网络药理学已

成为从集成多组分网络的角度揭示复杂疾病病理过程的研究热点[31]。本研究使用网络药理学方法探索了补肾药对熟地黄-山茱萸治疗AD 的活性化合物和潜在机制，并通过分子对接技术进行了初步验证。

本研究筛选出熟地黄-山茱萸药对治疗AD 的有效成分，并进一步通过拓扑参数筛选出关键核心成分。 其中，墙草碱、四氢鸭脚木碱和亚油酸乙酯等关键核心成分在以往研究中已被证明可通过不同机制改善AD 模型的记忆缺损。一项研究发现，包含墙草碱在内的黑胡椒果实提取物，可通过减轻雄性大鼠海马中的氧化应激来改善Aβ（1-42）诱导的空间记忆损伤[32]。 四氢鸭脚木碱可通过调节肾上腺素受体影响AD 患者Aβ 在中枢神经系统的清除[33]以及海马CA1 区神经元突触可塑性[34]。 研究显示，亚油酸乙酯通过靶向干预TNF 参与抗炎过程[35]，发挥治疗AD 的作用，还可以作用于线粒体呼吸链复合物I 的核编码亚基，抑制氧化应激以维持线粒体的功能稳态，从而抑制神经元死亡[36]。在以上研究基础上进一步的分子对接分析结果，从另一方面验证了熟地黄-山茱萸药对的这些关键核心成分与核心靶点，尤其是AKT1、MAPK3、TP53 和TNF 等有强烈的结合活性[37]。 这些结果进一步验证了该网络药理学预测的可靠性。因此，以上化合物可能是熟地黄-山茱萸药对治疗AD 发生作用的关键成分。

PPI 网络筛选出的关键靶点与AD 的病理过程密切相关，这与以往多项研究结果一致。 AKT1 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白参与细胞存活、生长，胰岛素信号转导等生物学过程。 研究发现，活性氧介导的AKT1 氧化修饰导致APP/PS1 转基因AD 模型小鼠的突触功能障碍[38]。 AKT1 基因的显著表达和磷酸化下调会损害海马神经元的增殖和分化，并促进神经退行性变[39]。 MAPK3 是一种抗凋亡基因，也参与神经元的突触可塑性[40]。 相关研究表明，在STZ 诱导的AD 模型大鼠中有些AD 相关蛋白激酶的基因表达有下调，但其中只有MAPK3 的表达变化显著[41]。Caspase-3 是细胞凋亡途径中最为关键的酶类之一。 研究表明，APP/PS1 转基因AD 模型小鼠Caspase-3 及裂解的Caspase-3 蛋白表达显著升高[42]。 小胶质细胞慢性产生TNF-α 引起与AD 相关的神经炎症反应，可能导致Aβ 和tau 蛋白过度磷酸化[43]。TNF 参与的神经炎症反应，可受筛选出的关键成分亚油酸乙酯的干预，从而发挥对AD 的治疗作用[35]。TP53 作为DAPK-1 和Ca2+/钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径的下游效应器，在细胞凋亡中发挥重要作用，被认为是AD 的潜在治疗靶点[44]。 VEGFA 已被作为AD 的新兴治疗候选物研究，经VEGFA 治疗的AD 模型小鼠恢复认知[45]。 以往研究显示，MAPK1 与神经退行性变、突触可塑性、细胞存活和AD 密切相关[46]。

根据GO 富集分析，潜在靶点主要富集在与AD等神经退行性变相关的BP 中，如配体依赖性的Notch 受体加工、生物碱代谢过程以及多巴胺分解代谢过程等。Notch 信号通路通过与跨膜Notch 受体结合的Notch 配体之间的相互作用被激活后， 使该信号系统改变而导致如Aβ 和p-tau 沉积等病理变化，以及随后的认知能力下降[47]。通过抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶可治疗AD 中重度阶段[48]。 多巴胺是公认的海马突触可塑性调节剂，其与背侧海马多巴胺能受体的结合是记忆编码的主要决定因素[49]。AD 患者和AD 实验模型中与该病相关的记忆功能障碍和多巴胺信号缺陷之间存在联系[50]。

KEGG 富集分析得到10 条与熟地黄-山茱萸药对治疗AD 密切相关的通路。 其中，AD 通路发挥的作用值得关注。 该通路种不仅有关键核心靶点AKT、CASP3、TNF 和MAPK1，还包含了胰岛素信号通路。 胰岛素信号通路与能量利用、线粒体功能和神经功能密切相关，氧化应激、突触可塑性和认知功能以及AD 的发生和发展部分归因于胰岛素信号通路的损伤[51]。神经活性配体-受体相互作用通路通过增强胆碱能功能调节学习和记忆能力[52]，并可能参与认知和情绪调节[53]。 Ca2+信号失调在AD 的突触病理学中起着重要作用[54]。 CACCAMO 等[55]证明，细胞坏死性凋亡在AD 人类大脑及在AD 小鼠模型中被激活，从而导致神经元丢失。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接技术，初步探讨了熟地黄-山茱萸药对通过多靶点、多成分、多途径治疗AD 的潜在作用机制，通过墙草碱、四氢鸭脚木碱和亚油酸乙酯等关键核心成分对核心靶点AKT1、MAPK3、CASP3、TNF、TP53、VEGFA和MAPK1 的表达以及不同BP 的调控，最终作用于AD、神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、细胞坏死性凋亡及炎症反应等相关通路，为进一步从熟地黄-山茱萸中提取活性成分提供了理论依据，也为中医药治疗AD 的深入研究提供了重要参考。然而本研究仍存在一定局限性，如两药在复方中不同配伍时活性成分的差异及核心靶点是上调还是下调等具体作用，有待今后进一步的体内外实验来验证。