天麻联苄类化合物32 对鱼藤酮损伤PC12 细胞的保护作用

吴苗苗，王惠芹，冯聚玲，苑玉和，石建功，陈乃宏*

（1.中国医学科学院药物研究所＆ 天然活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050；2.河北北方学院，河北 张家口 075000；3.湖南中医药大学湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，湖南 长沙 410208）

帕金森病（Parkinson diseases, PD）是一种慢性进行性神经退行性疾病，以静止震颤、肌肉强直、运动迟缓和共济失调等为主要临床表现，这些运动症状严重影响了患者的生活质量[1-2]。 流行病学调查研究发现，PD 患病率在过去的20 年内增加了一倍多，已经成为增长速度最快的神经系统退行性疾病[3]。 目前， 临床治疗PD 的大多数药物能很好地控制3～6年的症状，但不能阻止疾病的进程，过了这一时期，疾病发展加速，药物治疗往往达不到理性效果[2-4]。因此，研究开发治疗PD 的新药成为迫切需要解决的问题。

天麻为兰科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Blume 的块茎，首载于《神农本草经》，被列为上品，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效。现代研究发现，天麻钩藤饮对PD 患者具有较理想的疗效[5-6]。 天麻主要活性成分天麻素对体内、体外PD 模型具有改善作用[7-9]。 天麻联苄类化合物32 是从天麻中提取分离得到的新型联苄类化合物，结构式如图1。 对天麻联苄类化合物32 的生物活性研究尚未见报道，但有研究报道其同类型化合物20C 显示出很好的神经保护作用，具有抗凋亡、抗炎、调节免疫、抗内质网应激等生物活性[10-13]。 本文研究天麻新型联苄类化合物32 对鱼藤酮诱导PC12 细胞损伤模型的影响。

图1 天麻新型联苄类化合物32 的结构式

1 材料与仪器

1.1 细胞株

PC12 细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，由中国医学科学院药物研究所药理室传代并保存。

1.2 试剂和药品

DMEM（美国Gibco 公司，批号：12800-017-90482）；马血清（美国Hyclone 公司，批号：16050-122-979412）；鱼藤酮（批号：R8875）、噻唑蓝[3-（4,5-dimethyhhyhhiazol-2-y1)-2,5-diphenyhetrazolium bromide，MTT]（批号：11465007001）均购自美国Sigma 公司；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒（批号：556547）、JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒（批号：C2006）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测试剂盒（批号：S0033S）均购自碧云天生物技术研究所。天麻联苄类化合物32 由中国医学科学院药物研究所植物化学合成室提供。

1.3 实验仪器

MultiskanGo 型酶标仪（美国Thermo 公司）；IX70-142 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；2K15型通用台式冷冻离心机（德国Sigma 公司）；FACS Calibur 型流式细胞分析仪（美国Becton Dickinson公司）。

2 方法

2.1 细胞培养及实验分组

PC12 细胞常规培养于含5%胎牛血清、5%马血清的高糖DMEM 培养基中，置于37 ℃、5% CO2的孵育箱中孵育，每隔48 h 更换培养基，当单层培养细胞汇合80%以后，进行传代培养或实验。 实验时将PC12 细胞传入96 孔或6 孔培养板中，培养24 h，倒置显微镜下观察到细胞贴壁且生长状态良好时，更换培养基。 将细胞分为对照组、模型组、天麻联苄类化合物32 不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）组，共5 组。对照组更换正常培养基，模型组通过加入含有4 μmol/L 鱼藤酮的培养基损伤PC12 细胞48 h 建立PD 体外模型，天麻联苄类化合物32 不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）组更换含有4 μmol/L 鱼藤酮和天麻联苄类化合物32 不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的培养基，孵育箱中继续培养48 h 后，进行相关检测实验。

2.2 细胞于MTT 法检测细胞存活率

细胞于96 孔板培养48 h 后，于每孔加入10 μL的MTT，37 ℃、5% CO2的孵育箱中继续培养4 h，弃去培养基，每孔加入100 μL DMSO，震荡摇匀至晶体颗粒溶解，静置10 min，570 nm 在酶标仪上测定吸光度（A）值。 细胞存活率=实验组平均A 值/对照组平均A 值×100%。

2.3 Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术检测细胞凋亡

细胞于6 孔板培养48 h 后，使用0.25%胰酶消化，悬浮于无血清DMEM 中，4 ℃、800×g离心5 min，预冷PBS 清洗1 次， 细胞重悬于200 μL Binding Buffer 中，加入10 μL Annexin V-FITC 室温避光反应15 min，加入5 μL PI 和300 μL Binding Buffer，室温反应5 min，流式细胞仪进行检测。

2.4 JC-1 染色检测细胞线粒体膜电位

细胞于6 孔板培养48 h 后， 用37 ℃无血清DMEM洗涤1 次，每孔加入1.5 mL 的JC-1（5 mg/L）染料，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中反应20 min，37 ℃无血清DMEM 漂洗2 次，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 荧光探针法检测细胞内ROS 含量

细胞于6 孔板培养48 h 后，用PBS 缓冲液漂洗一次，每孔加入1.5 mL 的DCF-DA （终浓度为10 μmol/L），反应30 min，弃去上清液，用PBS 漂洗两次后在荧光显微镜下观察并拍照，检测的激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

2.6 统计学分析

实验数据采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料以“±s”表示，采用单因素方差分析进行统计学分析，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 天麻联苄类化合物32 对鱼藤酮损伤PC12 细胞存活率的影响

与对照组相比，模型组细胞存活率下降为（59.83%±5.27%），差异具有统计学意义（P＜0.001）；与模型组相比，在诱导同时给予天麻联苄类化合物32 不同浓度（1.0、10.0 μmol/L）可明显增加鱼藤酮损伤的PC12细胞的存活率，分别达到（67.22%±4.08%）和（88.71%±3.52%），差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。 详见图2。

图2 各组细胞存活率比较（±s，n=6）

3.2 天麻联苄类化合物32 对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的影响

在检测过程中对照组PC12 细胞有少量的损伤凋亡，模型组早期凋亡细胞数增加为17.67%。 在造模同时分别加入天麻联苄类化合物32 不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）后，早期凋亡细胞下降为11.02%、8.82%、9.63%，从而使活细胞比例增加。 上述结果提示天麻联苄类化合物32 可在一定程度上抑制鱼藤酮诱导的PC12 细胞早期凋亡，保护细胞免受损伤。详见图3。

图3 各组细胞凋亡情况

3.3 天麻联苄类化合物32 对鱼藤酮诱导的PC12细胞线粒体膜电位的影响

对照组PC12 细胞呈均匀的强红色荧光（99.29%±0.88%），线粒体膜电位水平较高，呈正常的状态；与对照组相比，模型组红色荧光强度减弱至（8.88%±2.07%），绿色荧光显著增强至（91.12%±2.08%），细胞线粒体膜电位降低；与模型组相比，天麻联苄类化合物32 不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）组红色荧光增强，绿色荧光显著减弱，分别为（32.25%±6.80%）、（30.76%±7.31%）、（23.94%±2.12%），说明线粒体膜电位水平升高，提示天麻联苄类化合物32 能抑制鱼藤酮损伤PC12 细胞的线粒体膜电位降低，维持线粒体稳定，但不同浓度之间没有显著性差异。 详见图4。

图4 各组细胞线粒体膜电位（±s，n=6）

3.4 天麻联苄类化合物32 对鱼藤酮损伤PC12 细胞ROS 含量的影响

对照组绿色荧光强度较弱，ROS 含量较少，而与对照组相比，模型组绿色荧光强度明显增强，细胞内ROS 含量显著增多（P＜0.001）；与模型组相比，天麻联苄类化合物32 不同浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）组绿色荧光强度显著减弱，细胞内ROS 含量均显著减少（P＜0.001）。 结果表明天麻联苄类化合物32 能显著降低鱼藤酮引起的ROS 含量，具有一定的抗氧化作用。 详见图5。

图5 各组ROS 含量比较（±s，n=6）

4 讨论

PD 的主要病理变化为黑质致密区多巴胺能神经元进行性死亡或缺失，虽然其发病机制尚不十分清楚，但有研究表明线粒功能障碍、氧化应激、细胞凋亡等与PD 的发生发展密切相关[2，14]。 鱼藤酮是实验室常用的一种神经毒制剂，能够通过引起线粒体功能障碍、氧化应激及诱导细胞凋亡等方式导致神经元损伤，广泛用于PD 细胞模型的制备[15-16]。 PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞克隆的细胞株，能表达酪氨酸羟化酶并合成多巴胺，是研究多巴胺能神经元常用的细胞系[17-18]。 因此，本实验以鱼藤酮损伤PC12 细胞建立PD 体外模型，研究天麻联苄类化合物32 的神经保护作用。

在细胞凋亡过程中，许多事件的发生都与线粒体密切相关，包括线粒体膜的通透性改变和跨膜电位降低，造成电子的漏出和自由基的产生，特别是增加细胞内ROS 生成，增加氧化应激，最终导致细胞调亡[19-20]。 线粒体膜电位降低是发生在细胞凋亡早期的事件，因此改善线粒体功能可抑制细胞凋亡的发生[21]。本研究首先通过MTT 法检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡，经鱼藤酮损伤后，PC12 细胞的存活率显著降低，出现大量细胞凋亡，而天麻联苄类化合物32 能够提高损伤PC12 细胞的存活率，抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡。 但同时也发现不同浓度天麻联苄类化合物32 对细胞凋亡影响的差异不明显，这可能与实验操作过程对细胞的损伤有关，或许细胞凋亡并不是天麻联苄类化合物32 改善鱼藤酮损伤PC12 细胞存活率的关键影响因素，这还需要进一步的研究。

JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位的特异性荧光染料，线粒体膜电位较高时，聚集在线粒体基质中，产生红色荧光；线粒体膜电位较低时，以单体形式存在于线粒体胞质中，产生绿色荧光，据此可判断线粒体膜电位的变化[22]。 本研究发现鱼藤酮损伤细胞后绿色荧光显著增强，红色荧光减弱，说明细胞线粒体膜电位水平显著下降；天麻联苄类化合物32 能显著降低绿色荧光、增强红色荧光，提高线粒体膜电位水平，但各浓度组之间没有显著差异。

鱼藤酮抑制线粒体复合物Ⅰ，导致电子的泄露和ROS 的产生，大量自由基可以损伤线粒体功能自身，线粒体功能障碍又会生成更多的自由基，二者互为因果，最终导致细胞死亡[23-25]。 本研究利用荧光探针DCFH-DA 检测细胞内ROS 含量，绿色荧光增强说明细胞内ROS 含量增加，鱼藤酮损伤后细胞绿色荧光显著增强，而天麻联苄类化合物32 可以显著降低ROS 的水平，具有较强的抗氧化作用。

综上所述，天麻联苄类化合物32 对鱼藤酮损伤的PC12 细胞具有保护作用，能降低线粒体膜电位水平，减少氧化应激，稳定线粒体功能，抑制细胞凋亡，是潜在的神经保护剂。 天麻联苄类化合物32 在本研究中显示出较强的抗氧化作用，或许与其神经保护作用相关，但还需进一步研究。