三种补肾方含药血清对衰老骨髓间充质干细胞中COL Ⅰ和ALP 的影响

黄 勇，董克芳，*，王 凡，杨强健

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

骨质疏松症是一种常见的慢性骨骼疾病，主要表现为骨量降低、骨小梁结构破坏、骨脆性增高，从而导致全身多处骨折[1]。 其机制主要是成骨分化减少和破骨分化增加，引起骨量的流失[2]。 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）可分化为成骨细胞，促进其成骨分化，提高骨量，是防治骨质疏松症的关键因素[3]。 骨质疏松症患者以老年人居多，机体的衰老在体内表现为细胞的衰老，导致细胞增殖和分化能力衰退。 因此，寻找可以促进成骨分化的方法诱导衰老BMSCs 向成骨细胞分化，是治疗骨质疏松症的重要研究方向。 临床上，与西药相比，中医药具有疗效好、安全性高和不良反应少等优势[4]。 健骨二仙丸是萧劲夫教授根据骨质疏松症的病因病机以及多年的临床经验创制，是由龟鹿二仙胶加续断、山药组成的经验方，并有研究证实，健骨二仙丸能有效促进成骨细胞增殖和分化，防止成骨细胞凋亡[5]。 而金匮肾气丸、六味地黄丸均是温补肾精的经典方剂，在治疗骨质疏松症等疾病方面具有显著的临床疗效[6-7]。 故本实验采用健骨二仙丸、 金匮肾气丸和六味地黄丸体外干预衰老BMSCs，研究其对衰老BMSCs 成骨分化过程中Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ, COL Ⅰ）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）表达的影响，以期探讨3 种补肾方治疗骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 雄性大鼠40 只，体质量（100±10） g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SYXK(湘）2019-0004，实验操作均在湖南中医药大学动物实验中心完成，动物使用许可证号：SYXK(湘）2019-0009。

1.2 主要药物、试剂与仪器

健骨二仙丸由龟板、鹿角胶、党参、枸杞子、续断、山药按1∶1∶3∶6∶6∶6 比例组成，共345 g；金匮肾气丸由干地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8∶4∶4∶4∶3∶3∶1∶1 比例组成，共81 g；六味地黄丸由熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮按8∶4∶4∶4∶3∶3 比例组成，共78 g。 超微饮品均由湖南中医药大学第二附属医院提供。

DMEM/F-12 培养基（赛默飞世尔科技有限公司，批号：ZQ1318）；大鼠BMSCs（武汉普诺赛生命有限公司，批号：CP-R131）；胰酶消化液、双抗（青链霉素）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0201、SV30010）；胎牛血清（美国Gibico 公司，批号：10099141）。

超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司，型号：YT-CJ-2NB）；直热式CO2培养箱（上海三腾仪器有限公司，型号：DH-1601）；倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司，型号：DSZ2000X）；低速离心机（上海知信实验仪器技术有限公司，型号：SL02）。

1.3 含药血清制备

将40 只SD 大鼠随机分为4 组，即空白血清组、健骨二仙丸组、金匮肾气丸组和六味地黄丸组，每组10 只；根据体表面积法换算剂量[8]，用药组按照健骨二仙丸75.9 g/kg、金匮肾气丸89.1 g/kg 和六味地黄丸85.8 g/kg 分别灌胃，空白血清组给予相同体积生理盐水灌胃，均每天定时灌胃2 次，连续7 d。于末次给药1 h 后，腹主动脉取血，置于无菌管中，分离血清上清液，0.22 μm 一次性滤过器过滤除菌，56 ℃水浴锅灭活30 min，-80 ℃超低温冷冻冰箱储存备用。

1.4 衰老BMSCs 制备及分组

将BMSCs 细胞株培养于含10% FBS+1%双抗的DMEM/F-12 培养基中，于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。 取P3 代用于实验，将P3 代细胞以5×103个细胞/孔种植于96 孔板中，用浓度为500 μmol/L 的30% H2O2分别处理24 h，制备衰老BMSCs。并将其分为6 组：模型组、诱导组、健骨二仙丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组、六味地黄丸含药血清组、空白血清组。

1.5 衰老BMSCs 成骨分化诱导

细胞分组完毕后，以2.0×105/cm2的浓度接种于6 孔板中，每孔加2 mL 含10% FBS 的L-DMEM培养液。 当细胞贴壁生长达到60%～70%融合时，将培养基更换为2 mL 成骨培养基（0.25 mmol/L 维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油和200 nmol/L 地塞米松的培养液）和0.2 mL 含药血清、0.2 mL 空白血清进行诱导，即诱导条件分别为：（1）模型组，DMEM/F-12 培养基；（2）诱导组，成骨培养基；（3）血清组，成骨培养基中分别加入金匮肾气丸含药血清、六味地黄丸含药血清、健骨二仙丸含药血清和空白血清。培养2 周，每3 天更换培养液1 次。

1.6 指标检测

1.6.1 形态学检测 采用β-半乳糖苷酶染色法镜下观察衰老和正常BMSCs，具体步骤如下：（1）吸除细胞培养液，用PBS 洗涤1 次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min；（2）吸除细胞固定液，用PBS 洗涤细胞3 次，每次3 min；（3）吸除PBS，加入β-半乳糖苷酶染色液；（4）37 ℃温箱孵育过夜，用封口膜封住6 孔板防止蒸发；（5）普通光学显微镜下观察，拍照。

1.6.2 Real-time PCR 法检测 在美国国立生物技术信息中心搜索目的基因的序列，运用Primer 5 软件设计引物，COL Ⅰ引物序列为：上游5'-TGAGCCAGCAGATTGAGAAC-3'，下游5'-CCAGT GTCCATGTCGCAGA-3'；β-actin 引物序列为：上游5'-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3'，下游5'-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3'。 Trizol 提取细胞总RNA，测浓度与纯度，逆转录cDNA，再行PCR 检测。

1.6.3 Western blot 法检测 提取细胞蛋白：用冰预冷PBS 洗涤细胞1 次，收集悬液，加入200 μL RIPA 裂解液，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min（离心半径10 cm）；采用BCA 法测定蛋白浓度，经凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温下脱色，摇床上封闭2 h；加入一抗（COL Ⅰ稀释比例为1∶2000）、二抗（鼠抗稀释比例为1∶5000）孵育后，用PBST 缓冲液漂洗3次，每次10 min；最后采用ECL 显色曝光成像。

1.6.4 ALP 测定 于诱导衰老BMSCs 第4、8 天时，收集细胞上清液，按ALP 测试盒说明书进行磷酸苯二钠比色法测定其ALP 活性。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 β-半乳糖苷酸酶染色结果

与正常BMSCs 细胞相比，500 μmol/L 的30%H2O2处理24 h 后的BMSCs 细胞被染成深蓝色，为染色阳性结果，可见经H2O2处理后的BMSCs 活性降低。 详见图1。

图1 β-半乳糖苷酸酶染色结果（×100）

2.2 各组衰老BMSCs 中COL ⅠmRNA 和蛋白表达水平比较

在第4、8、12、16 天，与模型组相比较，诱导组、空白血清组COL ⅠmRNA 和蛋白表达水平均升高（P＜0.05）；与诱导组、空白血清组比较，健骨二仙丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组COL ⅠmRNA和蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。 在第4、12 天，与诱导组比较，六味地黄丸含药血清组COL ⅠmRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。 详见表1、图2-3。

表1 各组衰老BMSCs 中COL ⅠmRNA 相对表达量（±s，n=3）

表1 各组衰老BMSCs 中COL ⅠmRNA 相对表达量（±s，n=3）

注：与模型组相比，*P＜0.05；与诱导组相比，#P＜0.05；与空白血清组相比，＆P＜0.05。

组别模型组诱导组空白血清组健骨二仙丸含药血清组金匮肾气丸含药血清组六味地黄丸含药血清组第4 天1.01±0.13 3.03±0.39*3.31±0.72*6.79±1.03*#＆5.01±0.24*#＆4.19±0.25*#第8 天1.43±0.13 4.11±1.28*4.53±0.85*8.16±1.05*#＆7.29±0.82*#＆5.46±0.43*第12 天1.70±0.11 6.08±0.28*7.00±0.60*10.98±0.87*#＆8.90±0.42*#＆7.28±0.63*#第16 天1.94±0.11 7.80±1.62*8.21±0.35*15.57±2.82*#＆11.88±1.14*#＆9.95±0.91*

图2 各组衰老BMSCs 中COL Ⅰ电泳图

图3 各组衰老BMSCs 中COL Ⅰ蛋白表达水平

2.3 各组ALP 活性比较

在第4、8 天，与模型组比较，诱导组、空白血清组ALP 活性表达均明显升高（P＜0.05）。 与诱导组、空白血清组比较，健骨二仙丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组、六味地黄丸含药血清组ALP 活性表达明显升高（P＜0.05）。 详见表2。

表2 各组ALP 活性（U/L，±s，n=3）

表2 各组ALP 活性（U/L，±s，n=3）

注：与模型组相比，*P＜0.05；与诱导组相比，#P＜0.05；与空白血清组相比，＆P＜0.05。

组别模型组诱导组空白血清组健骨二仙丸含药血清组金匮肾气丸含药血清组六味地黄丸含药血清组第4 天30.46±2.39 61.28±0.88*60.89±3.07*96.28±1.21*#＆101.03±0.85*#＆91.79±0.76*#＆第8 天36.83±1.34 67.74±0.38*72.15±1.97*#107.34±0.58*#＆115.45±1.54*#＆100.73±1.63*#＆

3 讨论

骨质疏松症是一种全身代谢性疾病，与年龄有相关性，在老年人中发病率高且骨折风险增加[9]。 中医学将之归属为“骨痿”“骨痹”，以肾精亏虚为主要病机[10]。 肾藏精，主骨生髓，为先天之本；肾精肾气充盛，骨髓则化生有源，筋骨得以濡养而强健有力[11]；若肾精亏虚，濡养乏源，则筋骨痿弱失用，表现为腰腿疼痛、酸软乏力[12]。 有研究[13]表明，补肾中药可以有效促进BMSCs 增殖和成骨分化，抑制破骨细胞生成，防止或减少骨量的丢失，起到治疗骨质疏松症的作用。龟鹿二仙胶为中医名方，方中含鹿角胶、龟板、人参、枸杞子4 味药，具有生精、补气、养血的功效；研究证实，龟鹿二仙胶能促进COL Ⅰ的合成、促进成骨细胞的增殖[14]。 而健骨二仙丸则是在龟鹿二仙胶的基础上加续断、山药，诸药合用，共奏补肾填精、滋阴补阳、壮骨强筋、续筋骨、健脾之功。金匮肾气丸[15]、六味地黄丸[16]分别为温补肾阳、滋阴补肾的经典代表方，广泛应用于临床，且疗效确切，均能促进成骨细胞分化或抑制破骨活性、促进骨形成、改善骨组织微结构、提高骨密度，以改善骨质疏松。

BMSCs 是一种具有多向分化潜能的干细胞，可分化为成骨细胞、成脂细胞和软骨细胞[17]。 研究证明，BMSCs 在骨质疏松症等骨病中起到积极的治疗作用，与中医理论“肾主骨”具有相似性[18-19]。 随着年龄的增长，机体内的细胞出现衰老，其增殖分化能力逐渐丧失，继之出现机体的退行性病变[20]。 而衰老BMSCs 成骨分化能力降低更倾向于成脂分化，与年龄具有相关性[21]，用于探讨补肾中药治疗骨质疏松症具有重要意义。

本研究结果显示，健骨二仙丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组在各个时间点均能促进COL Ⅰ的表达，且与诱导组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而六味地黄丸含药血清组亦能促进COL Ⅰ的表达，但与诱导组比较，仅在第4、12 天差异具有统计学意义（P＜0.05）。 ALP 是存在于骨组织中的骨形成标志物，是评价成骨能力的指标[22]，本研究显示在第4、8 天，健骨二仙丸含药血清组、金匮肾气丸含药血清组、六味地黄丸含药血清组与其余各组相比较，ALP 活性表达明显升高（P＜0.05）。

综上所述，健骨二仙丸、金匮肾气丸和六味地黄丸含药血清在诱导衰老BMSCs 成骨分化过程中能够上调COL Ⅰ和ALP 表达、促进细胞成骨分化、提高成骨能力。 今后将进一步加强其机制研究，为临床应用补肾法治疗骨质疏松症提供理论依据。