傣药红花臭牡丹根饮片质量标准研究

陆应彩 彭 霞 李 清 卯明霞 仁绍坤

西双版纳州食品药品检验所，云南 景洪 666100

红花臭牡丹根饮片为马鞭草科植物赪桐Clerodendrumjaponicum(Thunb.)Sweet的干燥根的加工炮制品。红花臭牡丹根的药材标准收载于《云南省中药材标准》2005年版第三册[1]，西双版纳地区傣医将红花臭牡丹根称为“哈宾亮”，意译为“疗效显著，名贵价高”[2-5]，傣医是四大民族医药之一，红花臭牡丹根、叶均作药用，为傣医常用药，具有清火解毒、活血止血、调经通乳、除风止痛、补土健胃的功效，用于治疗月经不调、痛经、赤白带下、产后缺乳；六淋证出现的小便热涩疼痛、尿黄、尿血；睾丸肿痛；脘腹胀痛，不思饮食，四肢乏力；风湿病关节肌肉肿痛[2-5]。预实验及文献报道[6-7]表明，红花臭牡丹根主要含有鞣质、酚酸类、黄酮类及挥发油等成分。近代药理研究发现黄酮类化合物具有神经保护、抗心肌缺血、抗胃溃疡、抗炎、抗肿瘤以及降糖等药理作用[8-11]。而目前尚无红花臭牡丹根饮片质量标准的研究[1-2]。故本文建立红花臭牡丹根饮片质量标准[12]，且参照《赪桐根中总黄酮的提取工艺》[7]及《肾茶总黄酮的含量测定》[13]采用芦丁为对照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色后，用紫外分光光度法对红花臭牡丹根饮片中总黄酮的含量进行研究以有效控制其质量并为其应用提供保障。红花臭牡丹植物图如图1。

(a)生境图

(b)生境图

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2600紫外分光光度计(岛津)；BGZ-76电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；SX2-4-10箱式电阻炉；TLCVisualizer2薄层色谱成像仪(瑞士卡玛)；OLYMPUS BX41生物显微镜(奥林巴斯中国有限公司)；BL310天平(德国赛多利斯集团)；AE200电子天平[梅特勒-托里多仪器(上海)有限公司,型号：MS205DU]；LC-300B数控超声波清洗器(济南市中区鲁超仪器厂)；UPH-IV-20T超出水机(四川优普超纯科技有限公司)；DFT-100A高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；DZKW-S-6电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；CAMAG Linomat 5半自动薄层点样仪(瑞士卡玛)；TLC Visualizer 2薄层色谱成像仪(瑞士卡玛)；RE-20000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SPS-04L气相色谱仪(安捷伦科技)。

1.2 试药 不同产地的10批药材分别采自云南景洪市、云南勐海县、云南勐腊县。由西双版纳州食品药品检验所彭霞主任药师鉴定为马鞭草科植物臭茉莉ClerodendrumphilippinumSchau. var. simplex C. Y. Wu et R. C. Fang。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201610，含量UV法测定，以92.6%计)。无水乙醇(分析纯)、氢氧化钠(优级纯)、亚硝酸钠(分析纯)、硝酸铝(分析纯)、石油醚(分析纯)、丙酮(分析纯)、盐酸(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、硫酸(分析纯)、二氯化钾、水合氯醛等均为天津市风船化学试剂科技有限公司生产，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 性状 本品为大小不一的类圆形及不规则块片，厚0.2～1.0 cm。外表面灰棕色至黄棕色，具不规则细皱纹，有少数凸起的支根痕。质硬，切面皮部较薄，木部宽广，黄白色，有横向裂纹，有的茎木髓部中空。气微，味淡。如图2所示。

图2 红花臭牡丹根饮片图

2.2 显微特征 粉末淡黄色。木栓细胞黄棕色，类长方形或类多角形，壁不甚厚；韧皮纤维多单个散在，长梭形，壁厚，孔沟明显，直径约为17～19 μm；木纤维成束，孔沟不明显，直径约为16～17 μm。导管为具缘纹孔，纹孔排列紧密，直径约为43～59 μm；石细胞众多，呈类方形、类长方形或类三角形，单个散在或集聚成群，壁厚，孔沟明显，胞腔内大多含草酸钙方晶，直径25～50 μm。淀粉粒众多，大小不一，多单粒，呈类圆形或类椭圆形，脐点十字形、裂缝状、点状，直径4～12 μm；复粒多由2～4分粒组成。草酸钙方晶直径11～22 μm。《云南省中药材标准》(2005年版第三册·傣族药)[1]收载“红花臭牡丹根”项下，未入标准。如图3所示。

2.3 薄层色谱鉴别 取本品粉末 1 g，加乙醇 15 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取红花臭牡丹根对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》四部通则0502)[14]试验，吸取上述两种溶液各 10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)- 丙酮(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

《云南省中药材标准》(2005年版第三册·傣族药)[1]收载“红花臭牡丹根”项下有薄层色谱鉴别一项。已纳入标准。按照药材薄层色谱条件，检测三个不同产地10批红花臭牡丹根饮片，薄层色谱图均一致，重现性好，符合规定，纳入标准。如图4所示。

2.4 检查项与浸出物 参照《云南省中药材标准》(2005年版第三册·傣族药)[1]收载“红花臭牡丹根药材”项下的规定及《中国药典》(2015版四部通则)[14]测定三个不同产地10批红花臭牡丹根饮片样品的水分(通则0832第二法)、总灰分(通则2302)、酸不溶性灰分(通则2302)、砷盐(通则0822第一法)，重金属(通则0821第二法)、有机氯农药残留量(通则2341，测定9种有机氯农药残留量)总六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、总滴滴涕(p,p＇-DDE、p,p＇-DDD、o,p＇-DDT、p,p＇-DDT之和)、五氯硝基苯；浸出物(通则2201用水作溶剂照水溶性浸出物测定法项下的热浸法)。各项测定结果均符合规定，结果均见表1。

表1 各项测定结果及限度 (n=2)

2.5 总黄酮的的含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，置 100 mL 量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取 20 mL，置 50 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每 1 mL 中含芦丁 0.3 mg)。

2.5.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL，分别置于 25 mL 量瓶中，各加水至 6 mL，加5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液 10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法(通则0401)[14]，在 357 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.5.3 测定法 取本品粉末约 0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80%乙醇溶液 100 mL，称定重量，置 85 ℃ 水浴上回流 1 h，放至室温，称定重量，用80%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 10 mL，置 25 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取 5 mL，置 25 mL 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至 6 mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量。按干燥品计算，含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计算。

2.5.4 吸收光谱的测定、光谱一致性检测 精密吸取芦丁对照品溶液、供试品溶液各 5 mL，分别置于 25 mL 量瓶中，照分光光度法，在200～800 nm 波长范围内测定吸收光谱，结果芦丁对照品与供试品光谱吸收图谱基本一致，在 357 nm 处有最大吸收。参照赪桐根中总黄酮的提取工艺优选[7]及肾茶中总黄酮的含量测定方法[2]，选取 357 nm 为检测波长。

2.5.5 线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL(相当于芦丁2.86282、5.72567、8.58846、11.45129、22.90257、34.35386、45.80515、57.25643、68.70772 μg/mL)，按上述测定法测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=0.0287528X+0.00831103，r2=0.99985，结果表明芦丁在2～68 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5.6 精密度试验 取同一批样品6份(产地：西双版纳景洪市曼蚌汤，批号：20190702)，按供试品测定方法测定，总黄酮的平均含量为5.32%，RSD为1.5%。

2.5.7 重复性试验 精密量取2.5.1对照品溶液(22.90257 μg/mL)，按“2.3”项下方法操作，依次测定7次，以吸收度值计算RSD为0.16%，结果符合要求。

2.5.8 加样回收率试验 根据《中国药典》2015版四部(通则9101)[14]，药品质量标准分析方法验证指导原则中准确度相关规定，设计同一浓度，9份供试品溶液按2.5.3方法进行测定。该分析方法的回收率为101.17%～107.89.20%，且RSD为2.4%，结果符合要求。

2.5.9 样品测定 取不同产地的10批红花臭牡丹根饮片，按照上述方法制备供试品溶液，按2.5.2确定工作曲线，以干燥品计算总黄酮含量。测定结果均符合规定，结果见表1。

3 讨论

3.1 试验条件的考察

3.1.1 含量测定试验 以芦丁为对照品采用分光光度法，以相应的试剂为空白，分别考察溶剂: 50% 乙醇、60%乙醇、70% 乙醇、80%乙醇；提取方式: 回流提取时间分别为60 min、90 min、120 min; 回流温度分别为75 ℃、85 ℃、95 ℃ ； 超声处理分别为30 min、45 min、60 min；溶剂量分别为25 mL、50 mL、100 mL；取样量分别为0.25 g、0.5 g、1.0 g、1.5 g制备的供试品溶液，在357 nm 波长处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果表明，取样量为0.25 g，100 mL 80%乙醇为溶剂85 ℃回流提取，红花臭牡丹根中总黄酮的溶出量最大，因此选取此方法制备供试品溶液。稳定性试验结果表明供试品溶液在30分钟内稳定性良好。

3.1.2 薄层色谱鉴别 本次饮片研究考察了薄层色谱的耐用性。不同厂牌的薄层板，硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂、青岛谱科分离材料有限公司、青岛胜海精细硅胶化工有限公司)；其它的方法验证《云南省中药材标准》(2005年版第三册·傣族药)[1]已收载。

3.2 限度拟定 各项限度是根据各测定结果照《云南省中药材标准》(2005年版第三册·傣族药)[1]收载“红花臭牡丹根药材”项下的限度拟定标准进行拟定，具体见表1。鉴于砷盐均符合规定暂不纳入标准，重金属均小于百万分之十暂不纳入标准，有机氯农药残留量中总六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、总滴滴涕(p,p＇-DDE、p,p＇-DDD、o,p＇-DDT、p,p＇-DDT之和)、五氯硝基苯均未检出故不纳入标准。