民族药黑锁梅根的生药学研究

段烘叶 张 洁 杨竹雅 杨剑启 余远盼 杨明瑞 龚大伟 李学芳*

1.云南中医药大学，云南 昆明 650500； 2.楚雄彝族自治州食品药品检验所，云南 楚雄 67500

黑锁梅根为蔷薇科悬钩子属植物红泡刺藤RubusniveusThunberg.的根[1]。别名钩丝刺、栽秧苗、钻地风、黑黄泡、冒毒绍劳聂(彝族名)、安何肋轻肯(纳西族名)。具有祛风除湿、解毒止痢等功效[2-3]。纳西族将根用于痢疾、胃痛、急慢性肾炎、附件炎、疝气、遗精、盗汗。藏族将去皮枝干用于流感、感冒、恶寒发热、肺结核、头痛、身痛[4]。研究[5-6]表明，红泡刺藤含有酚酸类、萜类、黄酮类和维生素等活性成分。黄酮具有抗炎症、抗过敏、抑制细菌、防治心脑血管疾病和抗肿瘤等作用[7]。黑锁梅根是我省少数民族常用药，在云南全省都有分布[8]，资源丰富，开发前景可观。目前，我国对黑锁梅根的研究主要集中在种质资源的评价和利用[9]；果实的研究主要有品质评价、生物活性成分的提取和抗氧化性等方面[10-12]。在性状鉴别、显微鉴别及理化鉴别方面尚属空白，为了确保临床用药的准确性、有效性和安全性，本实验对该药材进行了系统的生学药研究，为进一步的深入研究和质量标准研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Nikon E100型生物显微镜、生物数码摄影显微镜(日本Nikon)、RM223 徕卡切片机(Leica Biosystems Nussloch Gmbh)、HI121 徕卡摊片机(Leica Biosystems Nussloch Gmbh) 、Adobe Photoshop 2020简体中文版图形处理软件、电热恒温水浴锅DK 98 Ⅱ(天津市泰斯特仪器有限公司)、高速万能粉碎机(浙江省永康市溪岸五金药具厂)、标准检验筛(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司)、AR124CN电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)、KH7200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)、D28-2电磁炉(吴川市大昌电器有限公司)。

1.2 材料 石油醚(60～90 ℃，西陇科学股份有限公司)、氨水(AR，广东光华科技股份有限公司)、氯仿(云南杨林工业开发区滇池药业)、乙酸乙酯(AR，天津市致远化学试剂有限公司)、甲酸(天津市风船有限公司)、乙醇(AR，四川西陇科学有限公司)、95%乙醇(昆明远方生物制品有限公司)、无水乙醇(AR，昆明远方生物制品有限公司)、固绿FCF(国药集团化学试剂有限公司)、臧红T(国药集团化学试剂有限公司)、切片石蜡(上海懿洋仪器有限公司)、蜂蜡(中国医药上海化学试剂公司)。其余试剂均为分析纯。

本品采自昆明市西山区西山，中国科学院昆明植物研究所经雷立公研究员鉴定为蔷薇科悬钩子属植物红泡刺藤(RubusniveusThunberg.)的根。

2 方法

2.1 基源鉴别 原植物标本送请中科院昆明植物所鉴定，根据标本鉴定结果，描述植物形态并核对《中国植物志》。

2.2 性状鉴定 观察药材的形状、大小、颜色、表面特征、质地、折断面、气味等外观性状特征进行描述并拍摄药材照片。

2.3 显微鉴定 取新鲜药材药用部位(根部)切成完整厚度均匀的薄片进行脱水(30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→无水乙醇：TO(3∶1)→无水乙醇：TO(1∶1)→无水乙醇：TO(1∶3)→纯TOⅠ→纯TOⅡ→纯石蜡Ⅰ→纯石蜡Ⅱ)，按照常规石蜡制片方法制作石蜡切片，然后再进行染色(纯TOⅠ→纯TOⅡ→95%乙醇→1%番红→95%乙醇→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→无水乙醇Ⅲ→0.2%固绿→无水乙醇：TO(1∶3)→纯TOⅠ→纯TOⅡ)、封片。干药材打粉过60目筛，制成粉末临时装片，利用显微镜观察药材的组织构造、细胞形态等特征来，并描述分析。

2.4 理化鉴定 将药材粗粉(过40目筛)，分别制备水提取液、乙醇提取液、酸性乙醇提取液、石油醚提取液，并按照天然药物化学实验指导中进行化学成分的系统预试验，初步得出药材所含的各类成分、并对各类成分进行薄层色谱试验。

2.4.1 系统预实验

2.4.1.1 水提取液 称取黑锁梅根(根)粗粉5 g，置于100 mL锥形瓶中，加蒸馏水50 mL浸泡放置过夜，过滤，滤出约20 mL的滤液，用于检查氨基酸、多肽、蛋白质等化学成分。将剩下的滤渣同滤液于水浴60 ℃上热浸30 min，然后趁热过滤，滤渣舍去，滤液，用于检查糖、多糖、有机酸、皂苷、苷类、酚类、鞣质等化学成分。

2.4.1.2 乙醇提取液 称取黑锁梅根粗粉10 g，置于250 mL磨口三角烧瓶中，加入95%乙醇100 mL，于水浴上加热回流1 h，稍冷后加入蒸馏水36 mL使其含醇量为70%，冷至室温，过滤，滤渣舍去，滤液转移至分液漏斗中，用100 mL石油醚(60～90 ℃)萃取，分别萃取两次，每次50 mL，上层液(石油醚)舍去，下层液(乙醇提取液)浓缩至40 mL，加95%乙醇50 mL溶解后过滤，滤液，用于检查黄酮、蒽醌、香豆素、萜类、甾体化合物、内酯类化合物、强心苷、有机酸、酚类、鞣质等成分。

2.4.1.3 酸性乙醇提取液 称取黑锁梅根粗粉2 g，加0.5%的硫酸乙醇溶液10 mL，于水浴上加热回流10 min，过滤，滤渣舍去，滤液，用于检查生物碱类化学成分。

2.4.1.4 石油醚提取液 称取黑锁梅根粗粉1 g，加入石油醚(60～90 ℃)10 mL，室温浸泡2～3 h，过滤，滤渣舍去，滤液用于检查挥发油、油脂、萜类、甾体化合物等成分。

2.4.2 薄层色谱供试液的制备 称取3个不同产地的黑锁梅根粗粉5 g，置于磨口锥形瓶中，加95%乙醇50 mL，于水浴上加热回流1 h，稍冷后加入蒸馏水18 mL使其含醇量为70%，冷至室温，过滤，滤液转移至分液漏斗中；用50 mL石油醚(60～90 ℃)分两次萃取，每次用石油醚25 mL，以除去叶绿素等，分出下层乙醇提取液，浓缩至20 mL，加95%乙醇25 mL溶解后过滤，适当超声，滤液作为供试液。

3 结果

3.1 性状鉴定 本品干燥根呈圆柱形，挺直或稍弯曲，长约70 cm ，直径0.3～2.3 cm。表面黄棕色，有较密并深陷的细纵皱纹、排列稀疏的须根痕；质地坚硬，不易折断，断面略平坦，皮部棕褐色，较厚，木部淡黄色，略呈放射状，皮部与木部易剥离。气微，味微甜。如图1所示。

图1 黑锁梅根药材图

3.2 显微鉴定

3.2.1 根横切面 根横切面呈类圆形，木栓层由10余列扁平细胞组成，有石细胞散在，外被落皮层。皮层狭窄，排列紧密。韧皮部宽广，韧皮射线明显，向外渐弯曲。形成层呈环状排列。木质部发达，木纤维排列成环，导管单个或数个成群存在，分布较密集，呈放射状排列。薄壁细胞中含淀粉粒和草酸钙方晶。如图2 A、B、C所示。

A.全图；B.简图；C.详图；1.木栓层；2.皮层；3.韧皮部；4.形成层；5.木质部；6.射线；7.导管；8.草酸钙方晶；9.石细胞图2 黑锁梅根(根)横切面图

3.2.2 粉末特征 本品粉末黄棕色。木栓细胞呈多角形，壁略增厚，含黄棕色色素。导管多为具缘纹孔导管，较大，直径35～120 μm。纤维呈长梭形，单个散在或成束，壁厚2～15 μm，纹孔明显，直径10～35 μm。石细胞单个或成群存在，类方形、长方形或类圆形，壁厚2～8 μm。胞腔较大，纹孔明显，直径15～45 μm。淀粉粒类圆形、半圆形或不规则形，直径2～12 μm，脐点点状、短缝状、人字形，层纹不明显；复粒多见，由2～4分粒组成。草酸钙方晶多，直径5～18 μm。如图3所示。

1.木栓细胞；2.导管；3.纤维；4.石细胞；5.淀粉粒；6.方晶图3 黑锁梅根(根)粉末特征图

3.3 理化鉴定

3.3.1 主要化学成分 化学成分的系统预试验结果显示，黑锁梅根含有多肽、蛋白质、糖类、苷类、有机酸类、酚类化合物、鞣质、黄酮类化合物、香豆素类、挥发油等成分。见表1～表5。

表1 黑锁梅根冷水提取液化学成分预试结果

表2 黑锁梅根热水提取液化学成分预试结果

表3 黑锁梅根乙醇提取液化学成分预试结果

表4 黑锁梅根酸性乙醇提取液化学成分预试结果

表5 黑锁梅根石油醚提取液化学成分预试结果

3.3.2 薄层色谱 分别吸取3个不同产地乙醇提取液4 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，乙酸乙酯：甲酸：水(12∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干后用10%硫酸乙醇溶液显色后于105 ℃左右加热数分钟观察，昆明市西山区碧鸡镇、寻甸回族彝族自治县功山镇、嵩明县阿子营乡3个不同产地黑锁梅根药材供试液在同一块硅胶G板上的相同位置上显现相同的斑点，且不同产地对应的斑点颜色相同，重现性较好。如图4所示。

1.嵩明县阿子营乡；2.昆明市西山区碧鸡镇；3.寻甸回族彝族自治县功山镇图4 3个不同产地黑锁梅根的薄层色谱图

4 讨论

本文通过对黑锁梅根的来源、药材性状、显微及理化鉴别的研究结果表明：黑锁梅根横切面及粉末鉴别特征明显，可作为其真伪鉴别的专属性特征。化学成分丰富，薄层色谱重现性好，为进一步的深入研究和质量标准研究奠定基础。

在进行薄层色谱试验时，采用的是乙醇提取液作为供试液，分别以乙酸乙酯∶甲酸∶水(4∶1∶1)、乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶1∶1)、乙酸乙酯∶甲酸∶水(10∶1∶1)、乙酸乙酯∶甲酸∶水(12∶1∶1)等为展开剂展开，但最终以乙酸乙酯∶甲酸∶水(12∶1∶1)展开的成点性及重现性较好，其他比例的展开剂展开效果不佳，因所含成分复杂,拖尾现象严重，成点性不好。