固本平喘方纳米脂质体雾化吸入剂改善哮喘豚鼠病理状态的研究

贯 剑 宋红普 张晓晓 张 彤

1.河南省商丘市梁园区中医医院，河南 商丘 476000；2. 上海中医药大学，上海 200030；3.上海中医药大学附属普陀医院，上海 200062

固本平喘方具有益气平喘、脱敏解毒的功效,笔者在临床上长期使用雾化吸入剂治疗哮喘有较好效果，但方式多为简单的雾化吸入，多数临床观察[1-3]仅停留在经验层面，实验研究的机理不明确，本项研究，通过动物实验来客观地观察和评价其治疗效果，探讨其在细胞的作用机理。

1 实验材料

1.1 药物

1.1.1 治疗用药 固本平喘雾化吸入剂(以下简称固本平喘方)：每毫升含1 g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。

1.1.2 阳性对照药 小青龙合剂(湖北福广制药有限公司生产，国药准字Z42021495)。功能主治是解表化饮，止咳平喘,用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。每支装10 mL。

1.2 实验动物 英国种普通级健康豚鼠39只，体重250～300 g,均由上海中医药大学实验动物中心提供，普通级，实验动物合格证号[上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005]。

1.3 设备与试剂

1.3.1 设备 贝尔思超声雾化器(BSW-2A型)由鞍山市贝尔思电子有限公司生产。希森美康(XE-2100)全自动血球分析装置，由日本SYSMEX CORPORATIION公司生产。莱卡SP1600切片机由上海莱卡仪器有限公司生产。奥林巴斯CX31显微镜。隔水式恒温箱(PYX-DHS型)上海跃进医疗器械一厂生产。

1.3.2 试剂 卵蛋白粉(OVA )，国药集团化学试剂有限公司生产(批号：F20110811)。

2 实验方法

2.1 造模方法 将豚鼠正常饲养1周后开始进行致敏。第1天，先用75%乙醇溶液消毒局部皮肤后, 给哮喘模型组、高剂量组、低剂量组及中药对照组、西药对照组每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1.6 mL(6 mL/kg，另有0.1 mL损耗)致敏。空白对照组用0.9%生理盐水。第8天，再次注射致敏，各组剂量和方法同前。

2.2 模型评价指标 第14天开始激发引喘，将豚鼠置于4 L 的玻璃钟罩内用1%卵蛋白雾化吸入15～30 s，观察20～30 s，诱发哮喘发作(说明模型成功)。如豚鼠出现抽搐, 马上将其取出。以后隔天进行1次引喘，至实验结束。同时，从第14天起，引喘后1 h各组进行相应治疗。至第28天，各组动物处死，提取样本。

2.3 分组与治疗方法 A正常对照组：致敏、激发以及治疗均以0.9%生理盐水代替。B哮喘模型组：造模成功后每天吸入1%OVA溶液激发1次。C中药对照组：雾化吸入小青龙合剂1 g/次。D固本平喘吸入剂小剂量组：雾化吸入剂1 g/次。E固本平喘吸入剂大剂量组：雾化吸入剂3 g/次。F西药对照组：雾化吸入地塞米松1 g/次。

2.4 血常规检测 采用全自动血球分析装置自动分析血常规全套。

2.5 肺组织病理学检查 各组豚鼠分别于末次激发后24 h内用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸。取右肺下叶组织，置4%甲醛固定，24 h后酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察支气管周围炎性病变。

2.5.1 肺组织切片制备 ①切取标本同一部位组织，大小约2 mm×1 mm×1 mm;②以乙醇进行梯度脱水(80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次);③浸二甲苯2次，以透明;④用58 ℃低熔点石蜡浸蜡2次;⑤包埋蜡块;⑥5 um常规切片，裱于防脱片剂处理过的干净载玻片上;⑦置60 ℃恒温箱中烤片3 h，备用。

2.5.2 肺组织HE染色 ①切片以二甲苯脱蜡2次;②以乙醇进行梯度脱水(100%乙醇3次、95%乙醇2次、80%乙醇1次);③在蒸馏水中停留2 min后，以苏木素溶液染细胞核;④自来水冲洗，去掉浮色;⑤1%盐酸酒精分化;⑥蒸馏水漂洗后，以1%伊红酒精溶液染细胞质;⑦以乙醇进行梯度脱水(80%乙醇1次、95%乙醇2次、100%乙醇3次);⑧以二甲苯透明，树脂胶封片。光镜下观察。

3 结果

3.1 一般情况变化 各组在被激发后症状表现不同，正常对照A组豚鼠表现精神活跃、反应灵敏、呼吸平稳，无明显呼吸急促、困难和喘鸣音，模型组合各用药组豚鼠在吸入OVA后不久出现躁动、搔抓颜面等情况，部分豚鼠出现呼吸急促、腹式呼吸，甚至哮鸣音等。在末次激发时，小剂量治疗D组豚鼠未出现哮鸣音和呼吸困难，其他各治疗组均有2～3只豚鼠出现轻度呼吸急促、喘鸣等情况。

3.2 血常规变化 模型组与其他组比较，WBC、EO水平明显升高，差异有统计学意义。正常组较其他各组的EO水平均低，差异有统计学意义。D、E、F组的BA水平与模型组比较显著增高，D、F组与C组比较亦有差异。A组与B组的PMN差别有统计意义，其余各组无差别。B组与A组比较，LY有显著差别，D、E、F组与B组的差别也有统计学意义。详见表1。

表1 固本平喘方对哮喘豚鼠血常规的影响

表1 固本平喘方对哮喘豚鼠血常规的影响

组别nWBCEOBAPMNLy正常对照A75.10±2.54△0.04±0.06△0.11± 0.041.15±0.512.78± 1.33哮喘模型B610.15±2.270.15 ±0.03*0.37± 0.16*1.76 ±0.48*5.41 ±1.95*中药对照C65.90±2.32△0.10 ±0.03*△0.34 ±0.17*1.29 ±0.224.08 ±1.15小剂量治疗D85.62±3.28△0.10 ±0.03*△0.16± 0.07△#1.37 ±0.403.26 ±1.47△大剂量治疗E65.25±1.65△0.10 ±0.01*△0.21 ±0.10△1.36 ±0.393.59 ±1.30△西药对照F65.52±1.09△0.09 ±0.01△*0.19 ±0.11△#1.23± 0.653.47 ±1.82△

注：与A组比较，*P<0.05;与B组比较，△P<0.05;与C组比较，#P<0.05。

3.3 固本喘方对病理学的影响 肺组织病理学观察变化情况，A正常对照组：支气管及周围肺组织结构清晰，肺动脉壁轻度增厚,有2例伴有轻度间质性肺炎。B哮喘模型组：肺动脉壁增厚，细支气管腔内充满炎性分泌物,有2例伴有肺间质纤维组织增生。C中药对照组：肺内细支气管壁及管周见少量炎细胞浸润，腔内少量分泌物。小灶性肺组织结构破坏，伴部分肉芽组织增生。D固本平喘吸入剂小：肺动脉壁增厚，细支气管腔内少量分泌物，3例出现轻度间质性肺炎和局部间质性肺炎。E固本平喘吸入剂大：1肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎。2例出现局部肺组织破坏，伴肉芽组织增生。F西药对照组：肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎。2例出现肺组织结构破坏，另有1例局部肺出血。A组：图①、②；B组：图③、④;C组：图⑤、⑥;D组：图⑦、⑧;E组：图⑨、⑩;F组：图、(如下图所示)。

图1 各组病理学改变比较图

4 讨论

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，反复接触过敏原导致变态反应性炎症是多数哮喘发作的基本机制。中药复方固本平喘方(包括黄芪、白术、黄芩、甘草、麻黄、乌梅等)是临床经验方基础上结合现代研究进展优化配伍而成，具有益气平喘、脱敏解毒的功效。中药雾化吸入剂治疗哮喘有较好效果，但方式多为简单的雾化吸入，多数临床观察仅停留在经验层面，实验研究的机理不明确。

白细胞(WBC)升高是细菌性炎症的主要表现，但是在哮喘动物实验中也发现存在外周血WBC 增高的情况，有研究[4]表明中药复方能显著降低大鼠外周血WBC，较模型组有显著差异 。哮喘炎症的特征性标志是嗜酸性细胞(EOS) 的浸润，EOS细胞浆中含有嗜酸性细胞阳离子蛋白(ECP)、碱性蛋白(MBP)、嗜酸细胞衍生的神经毒素(EDN)、嗜酸细胞过氧化物酶(EPO)等特殊蛋白质颗粒以及多种炎症介质、细胞因子和氧自由基，EOS释放组胺，产生气道高反应性(AHR)，因此EOS是引起迟发相变态反应和气道高反应性的关键细胞，在介导气道变应性炎症参与支气管哮喘发病的调节中起重要作用[5]。同时，EOS 在气道的缓解期也处于高水平，与晚期哮喘反应和气道高反应性关系密切[6]。淋巴细胞(LY)包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，EOS分化、成熟、聚集又依赖于淋巴细胞的活化及其产生的细胞因子来调节，因此淋巴细胞在哮喘发病中也起了关键作用，它影响哮喘的发生和哮喘气道炎症及气道高反应性，其中T淋巴细胞具有“中枢性”调节作用[7]。笔者研究发现，模型组与其他组比较WBC、EO水平明显升高，差异有统计学意义，说明模型组的血液中EO增多，处于一种致敏状态。正常组较其他各组的EO水平均低，差异有统计学意义。B组与A组比较，LY有显著差别，D、E、F组与B组的差别也有统计学意义，提示造模后的豚鼠LY明显升高，而两个治疗组和西药组对于豚鼠外周血的LY有降低作用。

从各组的病理结果可以看出，正常组由于雾化等因素影响，存在肺动脉壁增厚和轻微炎症的情况。哮喘模型组的炎症情况最为严重，动脉壁增厚。中药对照组炎症情况减轻，伴有肉芽组织增生。两组治疗组同样有肺动脉增厚，并有轻度炎症存在。西药组存在肺组织结构受到破坏的情况，以上不排除外界感染的可能。