维吾尔药材睡莲花的质量标准研究

赵荣梅 艾买提江·阿衣甫别克 徐 鸿 于新兰 马国明

新疆维吾尔自治区药品检验研究院 中药(维药)质量控制重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054

睡莲花是睡莲科睡莲属植物雪白睡莲(Nymphaeacandida)的干燥花蕾，该植物生在池沼中，分布广泛，主产于新疆伊犁、阿勒泰和博湖地区，西伯利亚、中亚、欧洲也有分布[1]。维吾尔医认为睡莲花性质二级湿寒，具有降热止渴、益心护脑、祛乃孜来等功效，用于感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等[2-3]。文献[4-10]报道,睡莲花含有黄芪苷、烟花苷、紫云英苷、槲皮素3-O-木糖苷、槲皮素、槲皮素3′-O-β-D-吡喃木糖苷、异槲皮苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、芦丁等化学成分。

睡莲花作为维吾尔医的常用药材，在祖卡木颗粒、炎消迪娜儿糖浆、降热比那甫西糖浆等成药的处方中均有使用。现行质量标准现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维吾尔药分册中[3]，内容只有性状、粉末显微鉴别等项目。质量标准不完善导致企业无法全面控制药材质量。本研究的目的在于对其质量标准进行系统研究，保证用药安全。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BX-51型生物显微照相系统(OLYMPUS)；CAMAG TLC Visualizer型薄层色谱成像系统(瑞士卡玛)；KUDOS SK7210LHC型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自动点样仪；高效液相色谱仪(Agilent 1260型，DAD检测器；岛津LC-2010型，VWD检测器；Thermo Ulltimate 3000型；紫外检测器)；MS 204S型电子天平(Mettler toledo)；XT-1000A 型高速多功能粉碎机(浙江永康市红太阳机电有限公司)。

1.2 材料 山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品(批号：112007-201602，含量：90.8%，中国食品药品检定研究院)，硅胶G薄层预制板(批号：20200430，烟台市化学工业研究所)；甲醇、乙腈为色谱级(Thermo Fisher)，其他试剂均为分析纯。

睡莲花药材购自于新疆不同地区民族药材市场和民族医院，共19批次(产地为新疆的样品批号为：yfb1712004、yfb1712005、yfb1712006、Y1711021、H30134102、SLH-YP-170830、20170903；产地为巴基斯坦的样品批号为：20170905、1706018、170422；产地为河北白洋淀的样品批号为：yfb1712001、yfb1712002、yfb1712003、yfb1712007、yfb1712008、yfb1712009、Y1709009；产地为云南的样品批号为:201608；产地为成都的样品批号为：20170904)。由新疆维吾尔自治区药品检验研究院苏来曼·哈力克教授鉴定为睡莲科睡莲属雪白睡莲Nymphaeacandida。

2 方法与结果

2.1 性状 本品呈圆锥形或长圆形，多皱缩破碎。花蕾长2.5～4.5 cm，直径约2 cm，花托略呈方形。残留花梗，有纵棱，表面被短绒毛。花萼4，革质，近离生，长卵状披针形，无毛，表面绿色或黄棕色。剥去花萼可见白色或黄白色花瓣。雄蕊多数，花药线形，花丝扁平，几与花药等长。子房球形或椭圆形，无花柱或极短，柱头密排成轮状，中部有凹陷。气微，味淡。如图1所示。

图1 生态和性状特征图

2.2 显微鉴别 分别取药材细粉适量，置载玻片上，加水合氯醛溶液透化后，置显微镜下观察，拍照记录。如图2所示。结果可见：腺毛头部类圆形，由1～3细胞组成。非腺毛海星状，或碎断，基部细胞类方形，表面附有大量草酸钙方晶。花粉粒类圆形，直径30～60 μm。薄壁细胞中可见大量草酸钙结晶(砂晶、方晶或簇晶)。

草酸钙方晶;海星状非腺毛;花粉粒类圆形;腺毛图2 显微特征图

2.3 TLC鉴别 取本品粉末1 g，加甲醇10 mL，超声处理20 min，滤过，作为供试品溶液。另取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，加甲醇制成1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。如图3所示。

2.4 水分测定 按照《中国药典》2020年版四部通则“0832第二法”测定水分。见表1。

2.5 总灰分和酸不溶性灰分测定 按照《中国药典》2020年版四部通则“2302灰分测定法”测定。见表1。

2.6 浸出物测定 按照《中国药典》2020年版四部通则“2201浸出物测定法”测定，以水和不同浓度的乙醇为溶剂，采用热浸法和冷浸法分别测定浸出物含量，确定提取方式为以70%乙醇溶液为溶剂，采用热浸法测定醇溶性浸出物含量。见表1。

2.7 含量测定方法的建立

2.7.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350 nm，流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL。理论板数按山柰酚-3-O-芸香糖苷峰计算应不低于 4000。

表2 色谱条件

2.7.2 对照品溶液的制备 取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每1 mL含24 μg的溶液，即可。

2.7.3 供试品溶液的制备 取样品粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.7.4 系统适用性试验

2.7.4.1 线性关系的考察 精密量取山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液(51.07 μg/mL)1、2、3、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释制成系列标准溶液，按“2.7.1”色谱条件测定，以对照品溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=16.936×C+1.7465(r=0.9999)。结果表明，山柰酚-3-O-芸香糖苷浓度在5.11～51.07 μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.7.4.2 重复性试验 取同一批号供试品(批号：SLH-YP-170830)，按照“2.7.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.7.1”项下色谱条件进样分析，测定山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。以6次测定结果计算RSD值，结果山柰酚-3-O-芸香糖苷含量的RSD值为1.76%(n=6)，表明本方法的重复性良好。

2.7.4.3 稳定性试验 取同一批号供试品溶液(批号：SLH-YP-170830)，分别于0、2、4、6、8、12、14、18、24和32 h进样分析，测定山柰酚-3-O-芸香糖苷的峰面积。以10次测定的峰面积值计算RSD值，结果山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD值为0.32%。表明供试品溶液在室温放置32 h内稳定性良好。

2.7.4.4 精密度试验 取同一批号供试品溶液(批号：SLH-YP-170830)，按照“2.7.1”项下色谱条件连续进样6次，以6次峰面积值计算RSD值。结果山柰酚-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD值为0.28%，表明本方法精密度良好。

2.7.4.5 回收率试验 精密称取已知含量的供试品(批号：SLH-YP-170830)0.1 g，9份，分别置于置具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液适量，按照“2.7.3”项下方法制备得到高、中、低浓度的加标溶液。按照“2.7.1”色谱条件进样分析，计算山柰酚-3-O-芸香糖苷回收率。结果见表3。

表3 回收率试验数据 (n=9)

2.7.4.6 灵敏度 当S/N为3时，溶液浓度为检出限，即为0.145 μg/mL，RSD为1.9%；当S/N为10时，溶液浓度为定量限，即为1.146 μg/mL，RSD为 1.8%。

2.7.5 供试品的测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照“2.7.1”色谱条件测定，即得，按干燥品以外标法计算含量。如图4所示及表4。

A.对照品溶液色谱图 B.供试品溶液色谱图图4 HPLC色谱图

表4 样品含量测定数据

3 讨论

3.1 含量测定方法的考察 在考察样品前处理方法时，采用50%、70%、100%的甲醇和乙醇溶液作为提取溶剂，以1∶100、1∶125、1∶250、1∶500 作为料理比，超声时间分别为15、20、25和30 min提取，对同一批次睡莲花样品中的山柰酚-3-O-芸香糖苷含量进行测定，选择含量最高的提取方式为70%乙醇溶液为溶剂，超声功率为250 W，超声时间为30 min。在考察方法耐用性时，分别考察了不同品牌高效液相色谱仪、不同品牌及批号的同类型色谱柱、仪器流速、仪器柱温对含量测定结果的影响。实验结果表明，这些影响因素均未对测定结果有明显的影响。

3.2 检验项目限度的初步探索 本研究收集的样品具有代表性，水分含量为8.12%～10.39%，平均值为9.35%；总灰分含量为8.22%～11.76%，平均值为9.83%；酸不溶性灰分为0.11%～2.30%，平均值为1.18%；浸出物含量为31.47%～40.79%，平均含量为35.63%。与药材生长环境、产地的大陆性气候、炮制等相结合，拟定药材水分限度为不得过 12.0%；总灰分限度为不得过12.0%；酸不溶性灰分限度为不得过2.0%；浸出物含量限度为不得低于30.0%。山柰酚-3-O-芸香糖苷含量(%)为0.22% ± 0.035%(n=19)，按照国家药典委员会中药质量标准研究制定技术要求，按其平均值的±20%作为限度的制定幅度，以干燥品来计算含量，拟定含量限度为不得少于0.17%，并列入该品种质量标准草案正文内容。

《中国植物志》中记载标准规定的雪白睡莲在国内产于新疆，本课题组在收集样品时发现我国云南、成都、河北等地也生长雪白睡莲。因此，本课题组将这些产地的雪白睡莲也纳入研究范围，通过数据分析得知，河北白洋淀产的水分、总灰分和酸不溶性灰分含量最高，新疆和巴基斯坦进口的次之，成都和云南产的最低；但成都和云南产的浸出物和烟花苷含量最高，新疆和巴基斯坦进口的次之，河北白洋淀产的最低。此次对睡莲花药材进行了系统研究，修订了质量标准，该标准较全面反应睡莲花药材的质量。通过此次对雪白睡莲花的初步探索，对药材流通和质量监管方面具有一定的意义。