胀袋红烧肉和酱料包中产气微生物的分离与鉴定

张园园，朱瑶迪,2，李苗云*，赵莉君，刘世杰，赵改名，马阳阳，王心怡

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州 450000）

（2.河南恒都食品有限公司博士后工作站，河南驻马店 463700）

随着我国经济进入新常态，消费者越来越注重生活质量的提高，熟肉制品因具有营养、美味、即食等优点，深受人民喜爱。目前市场上的熟肉制品主要包括酱卤肉制品、发酵肉制品、腌腊肉制品、熏烧烤制品、香肠制品、油炸制品及其他熟肉制品[1-2]。不同风味酱料品类的出现使人们对调味酱的消费需求在不断提升，市场需求不断扩大，我国调味酱产业发展呈现逐年增长趋势[3-4]。熟肉制品和调味酱中富含丰富的脂肪和蛋白质，具有较高的水分活度，在制作和加工过程中一旦受到污染很容易造成微生物的大量繁殖，导致食品腐败变质，甚至引发食源性疾病[5]。在高温高湿季节，熟肉制品及酱料制品极易在贮藏、运输和销售过程中发生胀袋现象，造成大量的食物浪费和经济损失，是众多食品企业面临的主要问题之一[6]。

国内外有较多关于食品中胀袋微生物分离鉴定的报道，如杨颖等[7]从胀袋脆梅中分离出朗比克假丝酵母和藤黄微球菌；李靖等[8]研究发现引起红油豆瓣酱胀罐的微生物是地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌；Silva 等[9]从胀袋的巴西真空包装牛肉片中分离出嗜冷梭状芽孢杆菌；高鹏等[10]从胀袋的真空包装肘花中分离出地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和寡养单胞菌。但是有关引起红烧肉和酱料包胀袋的污染微生物报道较少，对于不同胀袋污染微生物应进行不同的针对性分离、鉴定和分析。

本研究从企业高投诉率产品中选择胀袋红烧肉、胀袋番茄酱和胀袋牛排酱为研究对象，对其进行微生物多样性分离培养，并通过形态学和分子生物学（16S rDNA）方法进行种属鉴定，确定导致红烧肉、番茄酱和牛排酱胀袋变质的关键微生物，并通过产气验证实验通过确定导致产品胀袋的微生物。通过探究引起这些产品胀袋的原因，针对性地制定质量控制措施，减少食品中危险因素的污染，保障肉制品与酱料制品的安全性，从而减少企业损失，保障消费者的健康，为食品安全发展奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

胀袋红烧肉，胀袋牛排酱，胀袋番茄酱，均为肉品企业提供胀袋样品。

1.2 主要仪器与设备

德国IKA VORTEX GENIU 旋涡混匀仪，北京佳源兴业科技有限公司；AL104 电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Nikon ECLIPSE 80i科研级显微镜，日本尼康公司；Electrotek AW200SG厌氧工作站，陕西鹏展科技有限公司；SHP-80 生化培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；日本HIRAYAMA-HVE50 高压灭菌器，华粤行仪器有限公司；Biometra TGradient 梯度PCR 仪，济南鑫贝西生物技术有限公司；德国Biometra DYY-12 电泳仪，北京市六一仪器厂；NAI-JZQ 灭菌型拍打式均质器，上海那艾实验仪器有限公司。

1.3 主要试剂

营养琼脂（NA）培养基、强化梭菌琼脂（RCM）培养基、乳酸细菌琼脂（MRS）培养基、酵母膏胨葡萄糖琼脂（YPD）培养基、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）培养基、革兰氏染色试剂盒，均购于青岛高科园海博生物技术有限公司；大肠杆菌测试片，购于长沙三行生物科技有限公司；PCR 检测试剂盒、离心柱型细菌DNA 提取试剂盒，购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 多种培养基分离微生物

分别从不同胀袋食品中中称取25 g 样品，加到装有225 mL 0.85%无菌生理盐水中，使用均质器拍打混匀。使用0.85%无菌生理盐水进行10 倍梯度稀释。使用稀释涂布平板法，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液各0.2 mL，分别涂布于NA、RCM、MRS、YPD 和TSC 平板上，大肠杆菌检测选择在大肠杆菌快检试纸片上进行，进行厌氧和好氧培养并计数。观察、记录优势微生物的菌落特征，挑取优势单菌落分离纯化3 次，最后接种到菌株磁珠保存管中，放于-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 微生物镜检

使用革兰氏染色法对分离纯化后的菌株进行微生物镜检，并判别微生物是革兰氏阳性还是阴性菌。通过观察分离到的微生物在平板上的菌落形态与在显微镜下观察到的个体形态，参考《常见细菌系统鉴定手册》[11]对其进行初步判定。

1.4.3 微生物种属鉴定

采用离心柱型细菌基因组DNA 序列提取试剂盒提取得到超纯的基因组DNA[12-13]，用于PCR 后进行凝胶电泳成像，DNA 样品由北京六合华大基因科技有限公司完成测序，进行菌株种属鉴定。菌株PCR 扩增所用反应体系如表1 所示，反应程序如图1 所示。

表1 PCR 扩增反应体系Table 1 PCR amplification reaction system

1.4.4 产气微生物的验证

配置NB 和YPD 液体培养基，分装于试管中，放入杜氏管，115 ℃灭菌20 min 备用。将各培养基上挑选出来的典型菌株纯化2～3 次，用无菌生理盐水将其制备成菌悬液，无菌条件下用移液枪吸取一定量的菌悬液加入到灭过菌的产气验证试管中，每种3 个平行，37 ℃培养并连续观察7 d，若管内产生气泡则为产气微生物。同时，用接入胀袋样品悬浊液的和接入无菌生理盐水的试管作为对照实验，以确保实验准确性。

2 结果与分析

2.1 分离菌株菌落及菌体形态观察

通过对胀袋红烧肉、牛排酱和番茄酱中的微生物进行分离、纯化，三种胀袋产品在MRS、TSC 培养基和大肠杆菌检测试纸片上均未检出微生物，在NA、YPD和RCM 培养基均有菌检出。根据各培养基上微生物的菌落形态进行分类，共得到9 种不同形态的优势菌，分别编号1～9，并进行形态观察和革兰氏染色镜检，菌落特征[14]和镜检结果如下表2 和图2 所示。其中，菌株1号和5 号菌为革兰氏阳性球菌，2、3、6、7 和9 号菌为革兰氏阳性杆菌，4 号菌和8 号菌为革兰氏阴性杆菌。

表2 9 种微生物的菌落形态Table 2 Colony morphology of nine gas producing microorganisms

2.2 细菌16S rDNA 基因序列同源性比对分析及系统发育分析

1～9 号菌株的16S rDNA 扩增电泳结果如图3 所示，序列基因序列全场约1500 bp。将测序得到的序列用BLAST软件上传至在NCBI-GenBank进行同源性检索分析，并通过比对结果构建系统发育树，结果如图4、表3 所示。分析可知，1 号菌株与多株枝状葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）的同源性达99%以上，故鉴定 1 号菌为枝状葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）。同理，2 号菌株为魏斯氏菌（Weissella cibaria），3 号菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），4 号菌株为巴氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii），5 号菌株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），6 号菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus strain），7号菌株为太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus），8 号菌株为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），9号菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表3 1～9 号菌16S rDNA 的BLAST 结果Table 3 BLAST results of 16S rDNA of No.1～9 strain

2.3 产气验证实验结果

通过微生物产气验证实验，确定了9 株菌株中导致红烧肉和酱料包胀袋的产气微生物，结果如表4 所示。经产气验证试验可确定3 号贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、4 号巴氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）、6 号蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、7 号太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus）和8 号弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）为导致红烧肉和酱料包胀袋的产气微生物，其中8号Citrobacter freundii的产气量高于其他产气微生物。空白样品试管未产气，胀袋红烧肉、胀袋牛排酱和胀袋番茄酱试管均不同程度产气，证明试验的准确性。

表4 微生物产气验证实验结果Table 4 Validation test results of microbial gas production

张小丽等[15]在胀袋酱油中分离纯化出巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），确定该菌株是引起产品胀袋的主要产气微生物。李慧等[16]研究发现地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是引起牛肉方便菜肴食品胀袋的主要污染源。张怀敏等[17]也确定了芽孢杆菌为老陈醋胀袋的主要产气微生物。芽孢杆菌在自然条件下极易形成芽孢休眠体，芽孢具有含水量低，抗逆性强和休眠特性等特点，能够对各种外界胁迫，如高温、干燥、紫外线、电离辐射以及多种化学物质等具有极强抵抗力，在食品工业杀菌后仍可存活[18]。残留在食品中的芽孢在产品的贮藏、运输和销售过程中，可能会由于外界环境的的波动引起食物腐败变质，导致产品胀袋[19]。综上所述，芽孢杆菌是引起不同包装食品胀袋的主要污染微生物，有效控制芽孢污染是解决食品胀袋问题的主要条件之一。

3 结论

本研究以胀袋红烧肉、胀袋牛排酱和胀袋番茄酱为研究对象，分离鉴定了导致红烧肉、牛排酱和番茄酱胀袋的产气微生物。采用多种培养基分离纯化出9种胀袋产品中的典型菌落，通过形态学和分子生物学（16S rDNA）方法进行种属鉴定，确定2 株革兰氏阳性球菌，分别为枝状葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；2 株革兰氏阴性杆菌，分别为巴氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）和弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）；5 株革兰氏阳性杆菌，分别为魏斯氏菌（Weissella cibaria）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。经产气验证试验鉴定出引起红烧肉和酱料包胀袋的产气微生物为Bacillus velezensis、Citrobacter braakii、Bacillus cereus、Bacillus pacificus和Citrobacter freundi。该结论为胀袋红烧肉、胀袋牛排酱和胀袋番茄酱中产气微生物的进一步溯源分析提供了依据，进而寻找并切断微生物的确切污染源，保障产品品质，提高食用安全性。