姜黄植物饮料对KM 小鼠的解酒作用

陈家明，焦春伟,2，梁慧嘉，钟静，谢意珍,2,3*

（1.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州 510663）

（2.广东粤微生物科技有限公司，广东肇庆 526000）

（3.广东省科学院微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东广州 510070）

中国酒文化历史悠久，适量饮酒有通风、散寒、舒筋、活血等作用；长期过量饮酒易致骨骼、肌肉疾病及四肢萎缩等病变，更严重的会导致酒精性肝脏损害，其表现为渐进性的肝脏脂肪变性，进而引起肝脏炎症、纤维化或硬化的发生，甚至恶化成癌症，严重危害人体健康[1-3]。市面上的“解酒药”主要为西药和中药，西药多是改善乙醇代谢的药物，不正确使用对身体存在毒副作用[4]；而解酒类中药以葛根、枳椇子等药材为主，大多局限于对单一原料的解酒功效研究[5]。目前市面上宣传有解酒作用的产品，虽然种类繁多，但大多存在作用机制不清晰、解酒效果不明显等问题。因此，开发成分安全、功效明确的天然解酒制品，并对其作用效果和作用机制进行探索，具有良好的社会效益和经济效益。

姜黄植物饮料（以下简称“姜黄饮”）由姜黄素、葛根、枳椇子、玉米低聚肽粉等组成，通过小鼠醉酒实验发现其具有解酒的功效。姜黄为姜科姜黄属植物姜黄（Curcuma longaL.）的干燥根茎，主要化学成分为酚类和萜类，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、胃肠道保护以及减轻酒精引起的肝损伤等作用[6,7]，其主要活性成分姜黄素通过改善线粒体功能和减轻内质网应激和炎症来减轻酒精引起的肝损伤[8]。葛根（Puerariae Lobatae Radix）作为我国传统医学中具有代表性的解酒药材之一，具有解表退热，生津、透疹、解酒等多种功效，其解酒的主要成分包括葛根素、总黄酮、多糖、多肽、黄豆苷元及其衍生物，具有抑制机体乙醇吸收、加快体内乙醇代谢、抗氧化、保护肝脏、心肌细胞及神经等作用[9,10]。枳椇是鼠李科枳椇属植物枳椇（Hovenia acerbaLindl）的成熟干燥种子，是传统常用的解酒护肝中药，主要包括黄酮、三萜皂苷、苯丙素类以及多糖等成分，具有保肝、解酒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等药理作用[11,12]，可提高酒后肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALDH）和微粒体乙醇氧化酶（EO）的活性，并可预防肝纤维化、酒精性和非酒精性脂肪肝[13]。玉米低聚肽是玉米蛋白经酶水解、化学水解或微生物发酵及特定小肽分离纯化技术获得的小分子多肽，具有抗氧化、抗高血压、保护肝脏、加快乙醇代谢、抗炎等作用[14]，其解酒机理主要包括激活乙醇代谢途径中相关的酶、抗氧化、增强肝脏代谢能力，调节脂质代谢及氧化应激反应，对酒精引起的肝损伤具有保护作用[15,16]。

本文对姜黄饮对KM 小鼠的解酒作用及可能的作用机制进行了研究，以期为新型解酒产品的研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

4 周龄雄性 KM 小鼠 48 只（许可证号：SCXK(鲁)2014-0007），体重25～28 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.1.2 样品与试剂

56 °红星二锅头酒，购自北京红星股份有限公司；ADH 试剂盒、ALDH 试剂盒、辅酶Ⅰ（NAD+）试剂盒、还原性辅酶Ⅰ（NADH）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；细胞色素P450（CYP2E1）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，购自武汉华美生物工程有限公司；苏木精-伊红（HE），购自广州永津生物科技有限公司；乙醇、甲醛，购自广州化学试剂厂；磷酸缓冲液（PBS），购自康宁公司；纯净水，购自华润怡宝饮料（中国）有限公司。

1.1.3 设备

M200 PRO NanoQuant 酶标仪，瑞士Tecan 公司；HM 340E 石蜡切片机、HistoStar 组织包埋机，美国Thermo Scientific 公司；5804R 离心机，德国Eppendorf公司；7890A 气相色谱仪，美国Agilent Technologies公司；ML-1600 显微镜，武汉康涛科技有限公司；ALT 160-4NM 型天平，德国KERN 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄饮料的制备

将葛根、枳椇子，按料液比1:12，1:10，加水提取两次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并提取液，过滤，滤液经减压浓缩、离心后加入配方量的姜黄素、玉米低聚肽粉等，搅拌至均匀，即得。分别配置姜黄饮低剂量组（JCL）（固含物0.2 g/mL；姜黄素含量0.92 mg/mL；总黄酮含量3.25 mg/mL），姜黄饮高剂量组（JCH）（固形物含量0.4 g/mL；姜黄素含量1.83 mg/mL；总黄酮含量7.39 mg/mL）。

1.2.2 小鼠防醉实验

取KM 小鼠48 只，按体重随机分为4 组，即空白组（C）、模型组（M）、姜黄饮低剂量组（JCL）和姜黄饮高剂量组（JCH），每组12 只。实验前禁食48 h，自由饮水。实验开始后，姜黄饮低剂量和高剂量组以0.2 mL/10 g 灌胃，空白组和模型组以同等量水灌胃。30 min 后，除空白组外，各组均以0.15 mL/10 g剂量灌胃红星二锅头酒，分别计时，记录醉酒潜伏时间（灌酒后到翻正反射消失）和醒酒时间（入睡开始直至翻正反射恢复）。

1.2.3 姜黄饮对醉酒小鼠血液中乙醇浓度的影响采用气相色谱法[17]测定小鼠血液中乙醇含量色谱条件：安捷伦DB-1701 毛细管柱（(14%-氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷为固定相，柱长为30 m，内径0.32 mm，膜厚度为0.25 μm）；进样口、柱温箱、检测器温度分别为200、90、250 ℃；载气N2、H2、空气流速分别为20、30、400 mL/min；FID 检测器；进样量：1 μL；分流比为30:1。称取乙醇（GC＞99.8%）1.0 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，摇匀，即得储备液（20 mg/mL）。精密移取储备液适量，用水分别稀释成浓度1、2、4、8、10 mg/mL，摇匀，即得工作标准液。以乙醇的峰面积为纵坐标（y），以乙醇质量浓度（mg/mL）为横坐标（x），绘制标准曲线，计算得回归方程为y=253.41x+9.0524（R=0.9991）。

1.2.4 姜黄饮对醉酒小鼠肝组织 ADH、ALDH、NAD+、NADH、CYP2E1、GSH-PX的影响

取血后将脱臼处死小鼠，取小鼠肝脏，经冷PBS（4 ℃）洗净、滤纸吸干水分后，称取其中的0.1 g加入至预冷的1 mL PBS 中，使用组织捣碎匀浆机制成匀浆，10000 r/min 离心15 min，提取上清液。按各试剂盒说明书操作测定上清液中ADH、ALDH、NAD+、NADH、CYP2E1 和GSH-PX 含量。

1.2.5 胃和十二指肠病理切片的观察

取小鼠胃和肠组织拍照后经4%甲醛固定，修块水洗，梯度乙醇溶液脱水至透明，浸蜡包埋，经组织切片机处理后得到厚度约为4 μm 的切片，通过苏木精-伊红染色，置于光学显微镜下观察。

1.2.6 统计学处理

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，实验数据用平均值x±SD 表示，多重组间比较采用One-way Anova。p＜0.05 为有统计学意义，p＜0.01 为有显著统计学意义，p＜0.001 为有极显著统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 小鼠防醉酒实验结果

空白组小鼠未摄入酒精，行为与正常小鼠无异。由表1 可知，模型组小鼠死亡率和醉酒率分别为41.67%和91.67%，姜黄饮低剂量组小鼠死亡率和醉酒率分别为33.34%和83.34%，高剂量组小鼠死亡率和醉酒率分别为16.67%和66.67%，说明姜黄饮能降低小鼠的醉酒率及醉酒引起的死亡率。模型组小鼠醉酒潜伏期和醒酒时间分别为74.00 min 和420.83 min，姜黄饮低剂量组小鼠醉酒潜伏期和醒酒时间分别为98.25 min 和344.58 min，高剂量组小鼠醉酒潜伏期和醒酒时间分别为235.00 min 和232.00 min。与模型组相比，姜黄饮低、高剂量组均能延长醉酒潜伏期、缩短醒酒时间，其中高剂量组的醉酒潜伏期显著延长，醒酒时间显著缩短，具有统计学意义（p＜0.05）。罗安玲等[5]研究发现葛根、藤茶、玉米低聚肽复合组方能显著延长小鼠的醉酒时间至55.14 min，缩短醒酒时间至75.88 min，明显改善醉酒小鼠的行为学指标（p＜0.05）。该结果与本实验的高剂量组类似，表明姜黄饮高剂量组有明显的解酒功效。

表1 小鼠的防醉酒实验结果Table 1 Results of anti-inebriation test in mice

2.2 小鼠血液中乙醇含量结果

各组小鼠经56 °红星二锅头酒灌胃8 h 后，测定血液中乙醇的含量，结果见表2。姜黄饮低、高剂量组小鼠血液乙醇含量分别为6.78 mg/mL 和4.21 mg/mL，与模型组7.29 mg/mL 比较，姜黄饮低、高剂量组均能降低血清乙醇含量，其中高剂量组血清乙醇含量明显下降，具有显著统计学意义（p＜0.01）。表明姜黄饮可有效降低饮酒后血液中乙醇含量。何会等[18]研究表明，枳椇子葛根中剂量复方能降低醉酒小鼠血清中的乙醇、乙醛含量，降低醉酒率。姜黄饮解酒机制可能与此研究类似。

表2 小鼠血液中乙醇的含量Table 2 Results of concentration of ethanol in blood of mice

2.3 姜黄饮对小鼠肝组织ADH和ALDH的影响

乙醇通过肝脏的氧化途径和肝外组织的非氧化途径进行代谢，其中氧化途径是最重要的乙醇代谢途径，包括乙醇脱氢酶系统、肝微粒体乙醇氧化酶系统、过氧化物酶体系。乙醇在ADH、微粒体乙醇氧化系统和过氧化氢酶的作用下氧化为乙醛，乙醛进一步在ALDH 的作用下氧化为乙酸[19,20]。ADH 和ALDH 是酒精代谢过程中的关键酶[21]，其活力的变化是评估酒精代谢快慢的重要指标。

如图1 所示，小鼠摄入乙醇后，会引起机体ADH、ALDH 活力的升高。姜黄饮低、高剂量组小鼠肝脏ADH 活力分别为2.76 U/mg prot 和3.74 U/mg prot。与模型组对比，姜黄饮低、高剂量组均可提高饮酒小鼠肝脏ADH 的活力（p＜0.05），表明姜黄饮各剂量组均能加快乙醇氧化为乙醛的速度，有利于乙醇的代谢。姜黄饮低、高剂量组小鼠肝脏ALDH 活力分别为6.63 U/mg prot 和8.36 U/mg prot。与模型组对比，姜黄饮高剂量组可以提高饮酒小鼠肝脏ALDH 的活力（p＜0.05），表明姜黄饮高剂量组能加快乙醛氧化为乙酸的速度，加速乙醇的代谢。该结果与陶施民等[22]研究结果相同，其研究发现葛根枳椇子栀子胶囊通过增强肝乙醇代谢关键酶ADH和ALDH及抗氧化酶活性，加快酒精在体内代谢的速度。

2.4 姜黄饮对小鼠肝组织NAD+和NADH 的影响

NADH 和NAD+参与许多重要的细胞反应，其在细胞中的水平及比例，决定了细胞反应进行的速度[20]。乙醇在肝脏中氧化代谢过程，ADH 将乙醇氧化成乙醛，同时伴随着辅酶NAD+还原为NADH 的过程，乙醇氧化会导致细胞质和线粒体中肝脏NADH/NAD+比率显著增加[23]。

如图2 所示，模型组NAD+含量为0.12 nmol/mg prot，与空白组相比极显著增加（p＜0.001），NADH/NAD+的比值显著降低（p＜0.01）。姜黄饮低、高剂量组NAD+含量分别为0.07 nmol/mg prot 和0.08 nmol/mg prot，与模型组相比显著降低（p＜0.01）；NADH 含量分别为0.34 nmol/mg prot 和0.39 nmol/mg prot，与模型组相比分别具有统计学意义和显著提高（p＜0.05，p＜0.01），NADH/NAD+的比值显著提高（p＜0.01），表明姜黄饮可加速NAD+向NADH 的转化，加速乙醇的代谢。

2.5 姜黄饮对小鼠肝组织细胞色素P450（CYP2E1）和GSH-PX 的影响

当机体乙醇浓度超过10 mmol/L，乙醇氧化系统被激活成主要的酒精代谢途径，细胞色素P450（CYP2E1）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸参与反应，将乙醇转化为乙醛[24,25]。如图3 所示，模型组小鼠肝脏CYP2E1 含量为58.11 pg/mg，与空白组相比极显著降低（p＜0.001），表明乙醇会降低小鼠肝脏CYP2E1的含量。姜黄饮低、高剂量组小鼠肝脏CYP2E1 含量分别为58.89 pg/mg 和78.51 pg/mg，姜黄饮高剂量组与模型组相比小鼠肝脏CYP2E1 含量极显著提高（p＜0.001）；低剂量组含量虽然没有显著升高，但也呈现升高的趋势，表明姜黄饮可提高肝脏中CYP2E1的含量，加速乙醇代谢，发挥解酒作用。该结果与郑连姬等[25]研究结果作用一致，其研究表明魔芋葡甘露聚糖通过提高肝脏中ADH、ALDH、P450 含量，加速乙醇代谢，发挥其防醉解酒作用。

GSH-PX 是肝脏细胞内主要的水溶性抗脂质过氧化的物质，其含量的高低决定着抗氧化能力的强弱[26]。酒精长期使用者，其肝细胞内GSH-Px 含量会明显降低甚至耗竭，其中肝脏中GSH-Px 减少在线粒体中最为明显，从而加剧对线粒体结构和功能的损害[27]。如图3所示，模型组小鼠肝脏GSH-Px活力为914.5 pg/mg，与空白组相比极显著降低（p＜0.001），表明乙醇会降低GSH-Px 的活力，机体抗氧化功能减弱。姜黄饮低、高剂量组小鼠肝脏GSH-Px 活力分别为1285.00 pg/mg 和1341.00 pg/mg，与模型组相比极显著提高（p＜0.001），表明姜黄饮可以增强小鼠肝脏中GSH-PX 的活力，提高其抗氧化能力，减轻乙醇代谢产物对机体的损害。该结果与范土贵等[28]研究结果类似，表明姜黄素超分子包合物通过提高细胞内SOD、GSH-Px 的活力以及降低丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量来改善乙醇诱导LO2 细胞的损伤。

2.6 姜黄饮对小鼠胃部和小肠的影响

如图4 所示，与空白组对比，模型组小肠可见明显的水肿和出血点，十二指肠损伤严重。与模型组相比，姜黄饮低、高剂量组小鼠小肠水肿和出血点明显减少，表明姜黄饮可减轻乙醇对小鼠肠道引起的损伤，减少小鼠肠道出血和水肿。

与空白组对比，模型组小鼠胃部可见明显的水肿。与模型组相比，姜黄饮低、高剂量组小鼠胃部均未出现水肿。表明姜黄饮对小鼠胃部和肠道有保护作用。

2.7 姜黄饮对小鼠胃部和十二指肠组织结构的影响

如图5 所示，模型组小鼠的胃粘膜可见明显的出血、粘膜下水肿，上皮细胞分离、脱落，腺体排列不规则等现象，而姜黄饮各剂量组均有不同程度的改善，其中姜黄饮高剂量组改善最为明显。这可能与姜黄饮中的姜黄素的含量有关。该实验结果与庞晓军等[29]研究解酒饮对急性胃黏膜损伤小鼠的保护作用相同，表明姜黄饮可以改善乙醇对胃黏膜损伤，具有护胃作用。Alejandra 等[30]发现姜黄提取物有较强的胃保护作用，提取物中姜黄素含量的变化会影响其在乙醇诱导的损伤大鼠模型中胃溃疡的预防作用，姜黄素的含量对于增强姜黄提取物的胃保护作用至关重要。

由图5 可见，模型组小鼠的十二指肠肠绒毛严重脱落，肠道机械屏障损伤明显。姜黄饮各剂量组均有不同程度的改善，其中姜黄饮高剂量组改善最为明显。表明姜黄饮可保护十二指肠，减轻乙醇对十二指肠的损伤。

3 结论

本研究以自制的姜黄植物饮料，通过构建高浓度酒精致小鼠醉酒模型，以小鼠防醉试验行为学变化、醉酒小鼠血液乙醇浓度、体内乙醇代谢关键酶的含量或活性及胃肠组织变化为指标，评价姜黄饮对小鼠的解酒作用。在姜黄解酒饮的干预下，小鼠醉酒率和醉酒引起的死亡率下降。与模型组相比，姜黄饮高剂量组醉酒潜伏期、缩短醒酒时间显著延长（p＜0.05），血液乙醇含量极显著降低（p＜0.01），乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶活力显著提高（p＜0.05），NADH/NAD+比值极显著提高（p＜0.01），细胞色素P450、谷胱甘肽过氧化物酶含量极显著提高（p＜0.01），表明姜黄饮能通过增强ADH、ALDH 活力，提高NADH/NAD+比值，增加CYP2E1 含量从而加快乙醇的代谢，有明显的解酒作用。通过增强小鼠肝脏中GSH-Px 的活力，提高其的抗氧化能力，减轻乙醇代谢产物对机体的损害。姜黄饮还能明显减轻乙醇对小鼠肠道引起的损伤，减少小鼠肠道出血和水肿。以上结果表明，姜黄饮具有解酒功效，对肝脏、胃部及十二指肠有保护作用，其作用机制可能与其增强机体乙醇代谢路径关键酶及抗氧化酶的活性，加快体内乙醇代谢速度，保护肝脏及胃肠道有关。