黑菊芋多糖的润肠通便和调节肠道菌群作用

姬妍茹，张正海，杨庆丽，董艳*，滕春波，李国巍，石杰，魏连会，潘静，高媛

（1.黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319）

（2.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040）

便秘是一种与肠道菌群密切相关的胃肠道疾病，临床表现主要包括排便困难、排便时间长、频率低，排便时伴有腹胀和腹痛等症状[1]。长期便秘会导致患者口干口苦、食欲不振、腹部胀满、精神状态不佳[2]，还会增加过敏性鼻炎、慢性肾脏疾病、静脉血栓栓塞、胃肠道癌等疾病风险[3,4]。在日常生活中，药物和饮食是缓解便秘的两种主要方式。由于药物的副作用，开发改善便秘的饮食已成为主流趋势[5,6]。

菊芋（Helianthus tuberosusL.）又名鬼子姜、洋姜，为菊科向日葵属多年生草本植物，在我国东北大部分地区、西北和江苏等沿海省份均有广泛种植[7]。菊芋块茎富含多糖，以果聚糖为主，具有调节肠道菌群，改善肠道微生态环境的功能[8,9]。鲜菊芋不耐贮存，口感较差，通过热加工可变成略带甜味的黑菊芋，其多糖组成发生改变[10]，抗氧化活性显著增强[11]。前期研究发现，黑菊芋水提液可以有效促进便秘小鼠的肠道蠕动、缓解便秘[12]，但关于黑菊芋多糖对便秘的影响和调控机制尚未得到广泛研究。基于此，本研究通过复方地芬诺酯建立便秘小鼠模型，以黑菊芋多糖对便秘小鼠进行干预，利用高通量测序探索其对小鼠便秘症状与肠道微生物组成之间的联系，以期为黑菊芋的保健功能揭示和加工工艺优化提供必要信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑菊芋，以“庆芋2 号”菊芋品种为原料，采用变温发酵工艺制备，具体方法参考文献[13]；复方地芬诺酯（国药准字H22022037），长春长红制药有限公司；小鼠粪便肠道微生物DNA提取试剂盒，德国QIAGEN公司。

1.2 仪器与设备

DS-SONIC-D400 型超声波清洗机，无锡市鼎实电子科技有限公司；TGL-20M 型台式高速冷冻离心机，金坛市国旺实验仪器厂；VFD-4500 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；Mi Seq 高通量测序系统，美国Illumina 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黑菊芋多糖的制备

参照文献[14]方法并优化，称取300 g 黑菊芋，加入1.5 L 蒸馏水浸泡12 h，匀浆后以40 kHz 的频率超声30 min，8000 r/min 离心10 min，上清液冻干后用1 L 95%乙醇沉淀多糖，蒸馏水复溶后依次采用氯仿-正丁醇体积比为5:1 的Sevage 试剂除蛋白，2%的活性炭脱色30 min，离心并冻干，采用苯酚-硫酸法以果糖含量为横坐标，540 nm 下吸光度为纵坐标，绘制总糖标准曲线。根据线性回归方程测定多糖含量并计算多糖提取率和纯度，计算方法如下：多糖提取率=冻干样品中多糖质量/黑菊芋中多糖质量×100%；多糖纯度=冻干样品中多糖质量/冻干样品质量×100%。

1.3.2 实验动物分组及处理

实验选用雌性SPF 级KM 小鼠，体重20±2 g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（吉）-2018-0007。饲养期间自由获取食物及饮水。将75 只小鼠适应性喂养5 d 后，随机分为5 组，即空白组（CK）、模型组（MC）和2.5、5.0、10.0 g/(kg·bw)的黑菊芋多糖低（BL）、中（BM）、高（BH）剂量组。

MC 组和BL、BM、BH 组采用0.2 mL 复方地芬诺酯（10 mg/(kg·bw)）诱导小鼠便秘，CK 组给予等量的生理盐水，1 次/d，持续14 d。从第8 d 起，给造模药1 h 后，采用0.2 mL 不同剂量的黑菊芋多糖治疗，CK 组和MC 组用等量的生理盐水代替黑菊芋多糖。

1.3.3 排便实验

14 d 后，各组小鼠随机取5 只，禁食16 h 后，除CK 组外其余各组灌胃10 mg/(kg·bw)复方地芬诺酯。30 min 后，黑菊芋多糖各剂量组分别灌胃0.2 mL 含相应受试物的墨汁，CK 组和MC 组给予等量的普通墨汁，记录小鼠6 h 内排出的黑便粒数。

1.3.4 小肠推进实验

14 d 后，各组小鼠随机取5 只，前期处理同排便实验，灌胃含相应受试物的墨汁30 min 后脱颈椎处死小鼠，测量小肠全长和小肠自幽门处至墨汁运动前沿的距离，计算墨汁推进率。

1.3.5 盲肠内容物收集

14 d 后，另取5 只各组剩余小鼠，禁食16 h 后，无菌解剖小鼠，收集盲肠内容物于离心管中，液氮迅速冷冻后-80 ℃冰箱保存，用于肠道菌群分析。

1.3.6 16S rDNA 文库构建与高通量测序数据分析

利用QIAamp DNA Stool Mini Kit 提取小鼠盲肠微生物总DNA，提取后检测基因组DNA 的浓度和纯度。根据通用引物扩增细菌16S rDNA，用于Illumina MiSeq平台高通量测序。测序送至北京百迈客生物科技有限公司完成，测序区域为V3～V4 区，测序引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTA-AT-3'）。采用QIIME软件中的UCLUST对Tags在97%相似度水平下进行操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚类分析，Greengene 数据库对各OTU 进行物种信息注释。

1.4 统计分析

每组实验3 次平行，采用SPSS 17.0 软件单因素方差分析（one-way variance analysis，ANOVA）进行统计学分析。字母不同代表差异显著（p＜0.05），字母相同代表差异不显著（p＞0.05）并利用GraphPad Prism 7绘制图表。

2 结果与分析

2.1 黑菊芋多糖的提取率和纯度

采用苯酚-硫酸法测定并绘制果糖标准曲线。果糖标准曲线方程为：y=0.379x+0.093，R2=0.999，方程拟合度较好。

如图1 所示，每100 g 黑菊芋中多糖含量为26.52 g，制备后的冻干样品质量为20.52 g，冻干样品中的多糖质量为16.96 g。黑菊芋多糖的提取率为63.95%，纯度为82.73%。

2.2 黑菊芋多糖对小鼠排便粒数和肠墨汁推进率的影响

图2 为不同剂量的黑菊芋多糖干预后，各组小鼠的6 h 内黑便粒数情况。据报道，复方地芬诺酯可以减少肠蠕动，延长食物在小肠的停留时间，降低排便次数[15]。因此，本研究使用复方地芬诺酯建立便秘小鼠模型。MC 组小鼠排便粒数明显低于CK 组（p＜0.05），说明模型建立成功。此外，与MC 组相比，3 组黑菊芋多糖治疗组均增加了小鼠6 h 内排便频率，BL、BM、BH 组分别增加48.21%、98.21%、78.57%，其中BM 组与CK 组相比无显著性差异（p＞0.05）。与黑菊芋多糖类似，在前期相同剂量的黑菊芋水提液对小鼠便秘影响的研究中，与MC 组相比，BL 组小鼠排便粒数无显著性差异（p＞0.05），BM、BH 组小鼠黑便粒数分别增加67.64%和85.29%[12]，提示黑菊芋多糖的通便功效优于黑菊芋水提液。

图3 为不同剂量的黑菊芋多糖干预后各组小鼠小肠墨汁推进率的分析结果。与CK 组相比，便秘建模显著降低了小鼠墨汁推进率（p＜0.05）。与MC 组相比，所有黑菊芋多糖治疗组均增加了小肠墨汁推进率（p＜0.05），较MC 组分别提高67.34%%、107.05%、87.08%，而且BM 组和CK 组差异不显著（p＞0.05），说明中剂量的黑菊芋多糖通便效果最佳。Shan 等[15]同样以复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，发现同属菊科植物的旋覆花多糖在100 和400 mg/kg 的剂量时能促进小鼠肠道蠕动，Jiang 等[16]则证明200 mg/kg 的榴莲果皮多糖可提高大鼠小肠推进率。

2.3 黑菊芋多糖对小鼠肠道细菌OTU 数量的影响

如图4 所示，从OTU 总数来看，MC 组OTU 数量为370 个，少于CK 组的376 个，BL、BM、BH 组OTU 数量分别为378、377 和374 个。5 组共有的OTU数为308 个，CK 组有而MC 组没有的OTU 数为23个，CK 组与BL、BM、BH 组共有但MC 组没有的OTU 数量是13 个。提示便秘小鼠的菌群多样性降低，给予黑菊芋多糖干预后，小鼠的菌群多样性得到改善。

2.4 黑菊芋多糖对小鼠肠道菌群Alpha多样性的影响

由图5 所示，对小鼠肠道微生物进行Alpha 多样性分析发现，各样品曲线趋于平缓，由此可见当前测序深度及覆盖度足够大。不同剂量黑菊芋多糖干预14天后，相对丰度曲线在X 轴上的跨度不同，体现出各组间肠道菌群组成可能有较大差异，各组中相对丰度高于10-2的微生物都较少。另一方面，在测序深度相同的情况下，MC 组丰度明显低于CK 组和BL、BM组样品，但高于BH 组，表明添加中、低剂量的黑菊芋多糖改善了便秘小鼠菌群的丰富度，而BH 组肠道微生物相对匮乏。

2.5 黑菊芋多糖对小鼠肠道菌群Beta 多样性的影响

如图6 所示，Beta 多样性分析发现，MC 组与CK组样本相距较远，说明复方地芬诺酯对小鼠肠道菌群组成影响较为明显。BH 组小鼠肠道细菌的均匀程度较低，彼此离散，且与CK 组距离较大。BL 和BM 组，特别是BM 组与CK 组相距较近，证明中剂量黑菊芋多糖干预治疗可一定程度恢复菌群平衡和结构多样性。

2.6 黑菊芋多糖对小鼠肠道菌群组成的影响

为探索黑菊芋多糖干预对小鼠肠道功能调控机制，通过16S rDNA 基因测序分析各组小鼠肠道菌群特征。如图7 所示，经OTU 聚类分析发现：在门水平上各组小鼠肠道菌群以拟杆菌门和厚壁菌门为主，其次为变形菌门（Proteobacteria）。与只能降解少部分特异性多糖厚壁菌门相比，具有广泛的多糖降解酶和碳水化合物代谢途径的拟杆菌门，更利于人体对多糖的消化吸收[17]。灌胃黑菊芋低、中剂量多糖后，厚壁菌门/拟杆菌门比值较MC 组分别降低了0.46%和8.68%，这与菊粉多糖[18]、黑木耳多糖[19]和杏鲍菇多糖[20]可以降低厚壁菌门/拟杆菌门比值的研究结果一致。此外，复方地芬诺酯干预后，在便秘发生机制中发挥着重要作用的变形菌门丰度由3.06%降低至2.00%，但经不同剂量的黑菊芋多糖干预后变形菌门丰度提高至2.94%～16.00%。变形菌门包含了大量致病菌，是肠道菌群失调的标志之一，然而有研究认为变形菌门是魔芋葡甘露聚糖缓解便秘的优势菌门[21]。黑菊芋多糖干预后，变形菌门丰度的提高对便秘的具体影响有待进一步研究。李丹丹等[22]对便秘小鼠模型进行了16S rDNA 基因测序，与健康小鼠相比变形菌门的占比显著降低。而在另一项研究中，由洛哌酰胺诱导便秘的小鼠肠道菌群中，变形菌门丰度增加[23]。推测可能与小鼠品种、喂养时间和环境等因素有关，说明肠道菌群紊乱虽然与功能性便秘存在相关性，但膳食干预诱导的便秘模型对引起的肠道菌群改变表现出个体差异性。

在属水平上，各组中拟杆菌科的Uncultured Bacterium FMuribaculaceae属、拟杆菌属（Bacteroides）、乳酸菌属（Lactobacillus）均为优势菌群。Muribaculaceae与肠道粘膜免疫系统相关，具有促进肠道代谢的功能[24]。在本研究中，便秘小鼠体内Muribaculaceae丰度由37.40%降低至27.08%，推测其可能是便秘的诱因之一。低、中剂量黑菊芋多糖干预后Muribaculaceae丰度分别提高至39.57%和38.03%，这与黑菊芋对正常小鼠肠道菌群的调节作用结果一致[25]。乳酸菌具有改善肠道环境、缓解便秘的作用，黑菊芋多糖呈剂量依赖性提高小鼠肠道中乳酸菌的丰度，BH 组丰度为MC 组的2.47 倍，说明黑菊芋多糖可以促进乳酸菌的增殖。此外，不同结构的多糖在肠道内以多种水解机制被发酵成短链脂肪酸，从而缓解肠道菌群紊乱引起的疾病。CK 组中产短链脂肪酸菌栖粪杆菌属（Faecalibaculum）丰度为0.62%，MC 组下降至 0.28%，黑菊芋多糖各组提高至1.99%～8.86%。既往的报道中，菊芋多糖也可以增加栖粪杆菌属丰度[8]。毛螺菌科中的Lachnospiraceae_NK4A136_group 被认为是一种益生菌，在增殖过程中可产生丁酸，其丰度水平与肠道炎症呈负相关[19]。但另有研究认为Lachnospiraceae_NK4A136_group 是与肠道菌群失调高度相关的条件致病菌[26,27]。与CK 组相比，MC 组的Lachnospiraceae_NK4A136_group 丰度显著降低（p＜0.05），为1.75%。BL 组恢复至3.44%，而BM、BH 组又降低至1.4%和1.2%。据报道，拟普雷沃菌是参与改善肠道粘膜屏障功能及炎症反应的重要细菌，其丰度被认为与脂代谢水平负相关[28]。值得注意的是，本研究中拟普雷沃菌属在正常组小鼠中占比为1.91%，而在便秘组中高达16.5%。低、中、高剂量黑菊芋干预后，拟普雷沃菌属分别降低至6.52%、4.31%和2.07%。

2.7 LEfSe 分析

如图8 中LEfSe 进化分支图分析显示，从门到属共有27 种物种有明显差异。中、高剂量黑菊芋多糖分别促进了Actinobacteria（放线菌纲）、Coriobacteriales（红蝽菌目）和Defluviitaleaceae 科的富集。在属水平上 CK 组 LEFSE 分析的优势菌属为Ruminiclostridium-9（瘤胃梭菌属）、Intestinimonas、Tyzzerella（泰泽雷拉菌属）、毛螺菌属_UGG_008 和Acetatifactor，MC 组的优势菌属为GCA_900066575和Akkermansia（阿克曼菌属），BL 和BM 组的优势菌属分别为Oscillibacter（颤螺旋菌属）和Defluviitaleaceae UCG-011。其中颤螺旋菌属被列为下一代益生菌的候选者，而Defluviitaleaceae_UCG-011与类风湿性关节炎的风险负相关[29,30]。

3 结论

本研究所采用的黑菊芋多糖纯度为82.73%，以复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，用不同剂量的黑菊芋多糖进行干预，观察6 h 内排便粒数和墨汁推进率，评价黑菊芋多糖的通便效果。发现不同剂量的黑菊芋多糖均有通便作用，与MC 组相比，2.5、5.0 和10.0 g/(kg·bw)黑菊芋多糖分别增加48.21%、98.21%、78.57%的小鼠黑便粒数和67.34%、107.05%、87.08%的小肠墨汁推进率，其中以5.0 g/(kg·bw)效果最佳。此外，对16S rDNA 测序观察肠道菌群丰度，发现与MC 组相比，5.0 g/(kg·bw)黑菊芋多糖干预可有效改善小鼠肠道微生物多样性及丰富度，显著增加厚壁菌门/拟杆菌比例和变形菌门丰度（p＜0.05），促进肠道有益菌乳酸菌属和栖粪杆菌属增殖（p＜0.05），一定程度逆转便秘造成的肠道菌群紊乱。综上所述，黑菊芋多糖对小鼠功能性便秘和肠道菌群具有调节作用，未来有望作为功能性食品用于缓解便秘。