凝结芽孢杆菌发酵乳的工艺优化

肖兰芳，赵珊，刘冬梅，吴晖

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

长期以来，发酵乳、奶酪常被用作益生菌乳制品载体[1]。研究发现，发酵乳与人的长寿和健康密切相关[2]，研究人员致力于通过添加益生菌、益生元和各种植物提取物等增值成分，赋予发酵乳额外的益生性质，使得益生性发酵乳在过去20 多年里赢得了巨大的市场[3,4]。目前，在发酵乳及其饮品中已商业化应用的益生菌主要为Lactobacillusspp.[5,6]、Bifidobacteriumspp.，代表性的菌种有Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus casei、Animal Lactobacillussubspecies、Bifidobacterium lactis、Bifidobacterium longum等。为促进益生菌的生长和活力，常在益生菌发酵乳及其乳饮料中添加棉子糖[7]、低聚果糖[8]和菊粉[9]等益生元。益生元的刺激作用取决于益生菌的种类和食物基质的性质。例如，乳饮料中B.animalisBb-12 和Lb.acidophilusLa-5 的生长不受菊粉或玉米纤维的影响，但聚葡萄糖显著刺激了这些益生菌在冷藏条件下的生长[10]。

凝结芽孢杆菌，作为新一代益生菌制剂，已有大量文献证实其在食品中应用的安全性[11,12]。其可分泌多种代谢产物，如脂肪酶[13]、木质素[14]，也可与其它菌群相互协调从而调节肠道菌群的平衡[15]、促进机体消化吸收营养物质[16]、增强机体免疫力[17]，进而调节机体的生理功能。美国FDA 早在1992 年批准凝结芽孢杆菌为安全可食用的益生菌，目前其已广泛应用到巧克力、面包、饮料[18]等食品中。国内自2016 年确定其可应用于食品后逐渐打开市场，已开发的产品有口服液、胶囊、乳酸及药品[16]，还有相关研究人员将其应用到益生菌糖果[19]、发酵饮料[20]及发酵乳[21,22]等食品中。此外，动物实验[23]表明凝结芽孢杆菌13002+低聚果糖（BCS+FOS）可恢复环磷酰胺（CTX）所引起的血清免疫球蛋白水平的降低，调节细胞因子水平，具有较好的益生特性。本文通过单因素、响应面试验探索添加低聚果糖的凝结芽孢杆菌发酵乳的发酵工艺，希望为新型发酵乳研发提供理论基础和拓展思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）13002[23-25]，由本课题组从中国传统自制发酵泡菜中分离筛选得到，并于2013 年保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC NO.7431；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）CGMCC 1.290，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）CGMCC 1.2741，购于广东省微生物菌种保藏中心。

全脂奶粉，雀巢（中国）有限公司；白砂糖，太古糖业有限公司；oligo -低聚果糖，量子高科（中国）生物工程有限公司；Volatile Free Acid Mix，SUPELCO；25%戊二醛，上海信裕生物工程有限公司；甲醛、无水乙醇、乙酸异戊酯、乳酸、浓硫酸（均为分析纯），广州市丛源试剂有限公司；海藻糖，广州蓝泽生物科技有限公司。

SPX-350B 型生化培养箱，上海坤天实验室仪器有限公司；TG 16G 型高速冷冻离心机，河北北弘实业有限公司；RHB80 型手持折光仪，石家庄泰斯特仪器设备有限公司；680 型多功能酶标仪，美国Bio-Rad伯乐；FiveEasy Plus 型pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LGJ-10A 型冷冻干燥机，上海豫明仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵剂制备

将凝结芽孢杆菌13002 干粉溶于无菌生理盐水，按3%（V/V）接种于其液体培养基中，经2～3 次活化培养后用无菌生理盐水洗涤离心（8000 r/min，4 ℃，10 min）三次，取菌泥。按菌泥：保护剂（10%的脱脂奶粉及10%的海藻糖溶于0.9%的无菌生理盐水）=1:3（m/m）混匀，冷冻干燥，收集冻干粉，凝结芽孢杆菌冻干粉活菌数为61.50×109CFU/g，-20 ℃下保存，备用。同上方法得保加利亚乳杆菌冻干粉活菌数为1.00×109CFU/g，嗜热链球菌冻干粉活菌数为1.00×109CFU/g，-20 ℃下保存，备用。

发酵乳的制备过程：将12 g 全脂奶粉和8 g 白砂糖混匀，加入100 mL 无菌生理盐水，85 ℃水浴灭菌30 min，冷却后接种发酵剂，43 ℃发酵4 h，4 ℃后熟12 h。

1.2.2 发酵乳的工艺优化

1.2.2.1 菌种复配比优化

将凝结芽孢杆菌（BCS）与传统发酵剂（保加利亚乳杆菌+嗜热链球菌，SL）按1:0、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、0:1 的比例，总接种量1%（m/V），43 ℃发酵4 h，4 ℃后熟12 h，探究菌种复配比对发酵乳品质的影响，并进行相关基本理化性质及感官的测定。

1.2.2.2 接种量优化

添加4%（m/V）低聚果糖，将凝结芽孢杆菌（BCS）与传统发酵剂（SL）按3:1 的比例，按不同的总接种量0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%（m/V），43 ℃发酵4 h，4 ℃后熟12 h，对发酵乳进行相关基本理化性质及感官的测定，探究得出最优菌种接种量。

1.2.2.3 低聚果糖添加量优化

添加低聚果糖0、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%（m/V），将凝结芽孢杆菌（BCS）与传统发酵剂（SL）按3:1 的比例，总接种量1.0%（m/V），43 ℃发酵4 h，4 ℃后熟12 h，探究低聚果糖添加量对发酵乳品质的影响，并进行相关基本理化性质及感官的测定。

1.2.2.4 响应面法优化工艺

由1.2.2.1～1.2.2.3 的实验结果，通过Box-Behnken软件进行3 因素3 水平的随机实验设计，如表1 所示。

表1 发酵工艺的因素水平设计Table 1 Factor level design of fermentation process

1.2.3 发酵乳基本理化指标测定

1.2.3.1 pH 的测定

取适量的发酵乳样品于锥形瓶中，pH 计校准后，测定发酵乳样品的pH，待示数稳定后读数并记录。

1.2.3.2 滴定酸度的测定

酸度按照GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》方法测定。

1.2.3.3 可溶性固形物的测定

用纯水校正阿贝折光仪，把待测发酵乳样品1～2滴滴在折光计的磨砂（样品）面上，从折光计上直接读出可溶性固形物含量值。

1.2.3.4 持水力测定

取适量发酵乳样品，记为m1，3500 r/min 离心10 min，将分离乳清倾倒掉，称量剩余物质的质量，记为m2。计算公式如下：

1.2.4 发酵乳的感官特性

感官评定小组成员的组成：选定华南理工大学在读本科生、研究生、教师等20 人。发酵乳样品的感官评价从色泽、滋味、气味、质构4 个方面进行，评价前对参与人员进行了相关评定内容的介绍及注意事项，评定过程中不告知样品类别、不互相探讨，感官评价指标如表2 所示。

表2 发酵乳感官评价指标表Table 2 The sensory evaluation indexes of yogurt

1.2.5 数据处理与分析

所有试验均重复3 次；采用Design-Expert 8.0.6 Trial 软件进行响应面分析；采用SPSS 软件进行显著性分析，数据表示为平均值±标准偏差，p＜0.05 认为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 菌种复配比对发酵乳品质的影响

不同菌种复配比的发酵乳的基本理化性质及感官评分如表3、图1 所示。由表3 可知，仅接种凝结芽孢杆菌进行发酵时，酸度仅为60.42 °T，与传统发酵剂1:1 进行复配发酵时，酸度显著提高，即适量的传统发酵剂可启动凝结芽孢杆菌的发酵，提高发酵乳的酸度值，可能与干酪乳杆菌和凝结芽孢杆菌偶联发酵从而提高凝结芽孢杆菌活菌数[26]原理一致；与发酵乳pH 值的对比中发现，复配比为1:3 时pH 值最低，而酸度值较低，说明pH 值与口感的酸度值并不对应，结合感官评价，配比为1:3 时酸度适中，并不是最酸的发酵乳。

如图1 所示为菌种不同复配比下发酵乳的感官评价结果，主要从色泽、质构、滋味、气味四方面进行评价。由表3、图1 可知，凝结芽孢杆菌占比太高，发酵乳酸度及风味不足，凝结芽孢杆菌占比太低，持水力较低、凝乳状态差，当复配比为5:1 与3:1 时，其酸度适中，凝乳状态良好，结合感官评分，复配比为3:1 时，发酵乳滋味、色泽及凝乳状态均处于较优水平。因此，选择菌种复配比的范围为2:1～4:1。

表3 不同菌种复配比对发酵乳基本理化性质及感官的影响Table 3 Effects of different mixture ratio of bacteria on basic physicochemical properties and sensory perception of fermented milk

2.2 接种量对发酵乳品质的影响

如表4、图2 所示，为不同接种量对发酵乳基本理化性质及感官品质的影响，可知，发酵乳的pH 随接种量的增加逐渐降低，酸度随接种量的增加而逐渐升高，且各组之间存在显著性差异，酸度值由66.94 °T升高至89.24 °T，其口感及风味产生显著变化，与钱志伟等[27]试验中随发酵剂添加量增加山药香蕉风味酸奶发酵加速，产酸量增加的结果一致。相比较而言，各组可溶性固形物及持水力则变化较为平稳，可溶性固形物保持在16%左右，持水力保持在50%左右。当接种量为1%、2%时，发酵乳的气味、滋味较为突出，且酸度适中，凝乳效果良好，综合感官评分高于80分，综合生产成本考虑，发酵乳最宜接种量为1%。因此，选择菌种接种量的范围为0.5%～1.5%，高于山药香蕉风味酸奶的发酵剂接种量0.2%[27]。

表4 不同接种量对发酵乳基本理化性质及感官的影响Table 4 Effects of different inoculations on basic physicochemical properties and sensory perception of fermented milk properties of fermented milk

2.3 低聚果糖添加量对发酵乳品质的影响

低聚果糖是由2～10 个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合糖，因其特有糖苷键和糖基，不易被单胃动物自身分泌的消化酶水解，且到达肠道后能被有益微生物利用从而促进肠道有益菌群生长和增殖[28]。研究发现，低聚果糖对凝结芽孢杆菌具有体外增殖作用[29]。因此，在发酵乳中添加低聚果糖作为碳源、改善口感。且前期研究表明低聚果糖可刺激凝结芽孢杆菌13002 的生长，如表5、图3 所示，为不同低聚果糖添加量对发酵乳基本理化性质及感官品质的影响。

由表5 可知，添加低聚果糖的发酵乳的各项品质均优于未添加低聚果糖的组别，尤其是可溶性固形物的含量，添加低聚果糖后显著上升，且感官评分结果表明，未添加低聚果糖的发酵乳感官评分最低，可见发酵乳中添加一定量的低聚果糖能够改善其味道与口感。pH 值随着低聚果糖添加量的增加逐渐降低，而酸度随低聚果糖添加量的增加先升高后降低，在低聚果糖添加量为1.0%、2.0%时，其酸度口感适宜，且综合经济利益与生产效率方面考虑，发酵乳中低聚果糖添加量范围为1.0%～2.0%。添加适量的低聚果糖可改善发酵乳口感、降低pH 值、增加酸度，与孙敏等[30]的试验结果相一致，其中添加3%的低聚果糖可有效降低低脂凝固型发酵乳与全脂发酵乳的差异。

表5 不同低聚果糖添加量对发酵乳基本理化性质及感官的影响Table 5 Effects of different oligofructose additions on basic physicochemical properties and sensory properties of fermented milk

2.4 发酵乳响应面优化

为使发酵乳酸度适中、具有良好的持水性、凝乳时间快、色泽及口感好、香气浓郁，通过2.2 单因素试验，确定发酵菌种复配比（A）为2:1～4:1，低聚果糖添加量（B）为1%～2%，发酵剂接种量（C）为0.5%～1.5%。根据Box-Behnken 设计的中心组合原理，选取3 个因子响应的3 个水平，使用Design-Expert 8.0.6 软件设计3 因素3 水平响应面实验，以滴定酸度为指标，确定凝结芽孢杆菌发酵乳的最佳发酵工艺参数。表6 为发酵乳响应面分析试验设计及结果。

表6 发酵乳响应面分析试验设计及结果Table 6 Fermented milk response surface analysis test design and results

如表7 所示，为响应面回归模型方差分析。由表7 可知，各因素对发酵乳的滴定酸度的影响大小依次为：C＞B＞A，即接种量＞低聚果糖＞菌种配比。回归模型的p＜0.0001，失拟项的p值为0.30，说明该回归方程极显著。失拟检验不显著，说明未知因素对试验结果干扰很小，不需要引入更高次数的项，模型恰当。

表7 响应面回归模型方差分析Table 7 Response surface regression model analysis of variance

通过软件分析可知，滴定酸度（Y）对自变量发酵剂菌种复配比（A）、低聚果糖添加量（B）、接种量（C）的多元回归方程：

该方程表达了发酵乳的滴定酸度和3 个自变量之间的关系是显著的，即这种方法是可靠的。回归方程交互项系数中BC 的交互系数比较大，说明低聚果糖添加量和接种量之间的交互效应大，而AC、AB 的交互系数相对较小，说明发酵剂菌种复配比和接种量、低聚果糖添加量和菌种复配比之间的交互效应较小。

通过软件分析可知，该模型的决定系数R2及R2Adj均＞0.9，说明该方程与实际情况拟和良好，较好地反映了酸度与菌种配比、低聚果糖添加量、接种量的关系。说明该模型相关性良好，实验稳定可信度较高。

为了检验方程的有效性，对测定的发酵乳中的滴定酸度的数学模型继续进行方差分析，并进一步检测各因子的偏回归系数。结果表明，一次项中C 的回归系数高度显著，p＜0.0001，说明接种量对发酵乳的滴定酸度有高度显著作用。B 的回归系数仅次于C，说明低聚果糖的添加量对发酵乳的滴定酸度的影响仅次于发酵剂接种量。具体响应曲面如图4 所示。

2.5 验证实验

使用Design-Expert 8.0.6 软件处理试验数据后，预测发酵乳的最佳工艺条件为：菌种复配比（凝结芽孢杆菌：传统发酵剂（A）3.22:1、低聚果糖添加量（B）1.56%、接种量（C）1.315%，理论滴定酸度值为93.25。考虑实验实际情况，对发酵工艺参数调整为：菌种复配比（凝结芽孢杆菌：传统发酵剂）（A）3:1、低聚果糖添加量（B）1.50%、接种量（C）1.50%。进一步验证预测值，在最佳发酵工艺参数下，多次进行平行试验，测定发酵乳的平均滴定酸度值为90.59，与模型预测酸度值（93.25）拟和率达97.15%，说明该模型可行性较高。

3 结论

将凝结芽孢杆菌13002 用于发酵乳的发酵，通过单因素及响应面试验确定了最优发酵工艺为：菌种复配比（凝结芽孢杆菌:传统发酵剂，即BCS:SL）3:1、低聚果糖添加量1.50%、接种量1.50%、总接种量1.00×109CFU/100 mL、43 ℃发酵4 h后4 ℃发酵12 h，并验证预测值，在最佳发酵工艺参数下，进行三次平行试验，与预测值拟和率达97.15%，模型具有较高的可行性，为定制发酵剂的制备提供了新的可能性。