基于模糊层次分析法优选复方土茯苓止痒喷雾最佳提取工艺路线

梅凯 李鑫 李婷婷 郝逗逗 王灵敏 王昕怡 陈佳佳 刘葭 吴清

提取工艺作为制备中药复方制剂的关键环节，直接影响制剂质量及临床疗效，优选提取工艺路线需要参考各药味所含成分的理化性质和药理作用，并结合制剂工艺和大生产实际情况[1-2]。由于中药具有多成分、多靶点的特点，设置多指标及其评价成为了优化中药复方制剂的关键。模糊层次分析法(fuzzy analytic hierarchy process, FAHP)是将模糊层次法和层次分析法结合，将评价指标和对象划分为不同层次，同一层次的指标通过两两比较重要程度，组成模糊矩阵，通过计算得到各评价指标的权重系数[3-4]。本实验以冰苓止痒喷雾为模型药，研究模糊层次分析法在中药提取工艺路线优选中的应用。

瘙痒是一种可以被机械、化学刺激所诱导的强烈搔抓欲望的感觉，也是糖尿病、胆汁淤积症和艾滋病等系统性疾病的临床表现[5-6]，调查发现，13.5%的成人患有瘙痒症，严重影响患者的生活质量，需要及时治疗[7]。目前对瘙痒症的治疗还仅限于抗组胺药，局部和全身糖皮质激素或某些抗过敏药、抗抑郁药、抗癫痫药的应用，但有一定的副作用[8-10]。

复方土茯苓方是临床上治疗瘙痒的有效中药复方，由土茯苓、徐长卿和防风等药味组成，共奏祛风止痒，清热利湿的功效。临床应用时为全方水提后外用，制备工艺简单，但是有效成分利用率低，使用不方便。因此本论文对冰苓止痒方提取工艺进行考察，以优化制剂前处理方法。通过查阅方中各药味的理化性质和抗瘙痒作用的强弱，参考原制剂工艺的临床应用方式，设计两条提取工艺路线，选择化学指标结合药效学指标作为评价指标，通过模糊层次分析法赋权、确定各因素指标合成权重，得到各工艺路线加权综合得分，根据背部皮肤病理切片结果进行验证，优选出最佳提取工艺路线。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

CP-7800C型剃毛器(科德士电子厂)；低速离心机[艾卡仪器设备(广州)有限公司]; BH-2型光学显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)；Ultimate 3000高效液相色谱仪(日本岛津公司)；可变波长检测器(日本岛津公司)；INERTSIL ODS-3色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；RE-501型旋转蒸发仪(北京神泰伟业仪器设备有限公司)；BZF50型真空干燥箱(上海BOXUN公司)；BT 125D电子分析天平(北京赛多利斯公司)；电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)；JY20002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式真空泵(北京神泰伟业仪器设备有限公司)；SB-5200 DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2 实验药物与试剂

土茯苓(北京三和药业有限公司，批号：11050301)；苦参(北京三和药业有限公司，批号：10620301)；防风(北京三和药业有限公司，批号：103503101)；苍耳子(北京仟草中药饮片有限公司，批号：200915009)；艾叶(北京仟草中药饮片有限公司，批号：210626006)；徐长卿(北京仟草中药饮片有限公司，批号：20190541)；落新妇苷(批号：J29GB153016)、丹皮酚(批号：L15D9D77791)、升麻素苷(批号：S25GB162330)，以上标准品含量≥98%，均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色谱级，美国Sigma)；冰醋酸(天津市致远化学试剂有限公司，批号：2021032040)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；4-氨基吡啶(Adamas-beta，批号：P1780631，用生理盐水配成0.01%溶液)；生理盐水(山东华鲁制药有限公司，批号：SD21010212)；复方醋酸地塞米松乳膏(华润三九医药股份有限公司，批号：2107016S)；脱毛膏[利洁时家化(中国)有限公司]；小鼠组胺定量检测试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)购于泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级ICR小鼠(23±2) g，雌雄各半, 斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010。

1.4 提取工艺路线设计

复方土茯苓方中君土茯苓临床上用于多种皮肤病，包括足癣、湿疹和银屑病等[11]。土茯苓中含有糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮和黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等多种化学成分，其中黄酮及黄酮苷类包括黄杞苷、异黄杞苷、落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷等，而落新妇苷是土茯苓中关键的活性成分和质量控制指标成分，为二氢黄酮醇苷类化合物，《中华人民共和国药典》中规定土茯苓按干燥品计算，落新妇苷含量不得少于0.45%，具有抗炎、镇痛、抗菌等多种生物活性[12-15]，文献报道落新妇苷能够抑制白介素-6(interleukin- 6，IL- 6)、白介素-1β(interleukin- 1β，IL- 1β)的表达、乙酸引起的小鼠扭体反应，对代表性的腋窝皮肤菌群有抑制作用[16-17]。

臣药徐长卿目前较多地应用于皮肤类疾病，具有抗炎、镇痛等作用。罗怀宇[18]发现含徐长卿提取液的牙膏样品对急性炎症具有明显作用；徐长卿水煎剂可使小鼠扭体反应潜伏期明显延长，扭体次数明显减少[19]。文献报道和《中华人民共和国药典》已明确徐长卿的主要有效成分为丹皮酚[13,20]，丹皮酚可缓解二硝基氯苯诱导的小鼠特应性皮炎样皮损的症状[21]。臣药防风中的色原酮类成分，是其发挥药效的主要物质基础，防风提取物及色原酮类单体成分均有解热、镇痛、抗菌作用[22]，《中华人民共和国药典》也明确了升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷两种色原酮成分为防风的质量控制指标成分[13]。静脉给药防风色原酮单体，发现对致热大鼠和热板致痛小鼠有较好的解热镇痛作用[23]，赵娟等[24]发现防风色原酮提取物对大鼠关节炎发病率起到明显的抑制作用。

君药土茯苓主要活性成分落新妇苷、臣药徐长卿主要活性成分丹皮酚和臣药防风主要活性成分升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇苷都具有水溶性差的特点，而其余三味中药在方中占比小，能够溶于乙醇，考虑到成本、时间等因素，故提取工艺路线一采用全方醇提，提取工艺路线二参考临床用法，全方水提。

工艺路线一：(醇提组)称取处方量的冰苓止痒方饮片，以8倍量70%乙醇为提取溶媒，回流提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，滤液减压浓缩至生药量为1 g/mL(1∶1)，放冷后，备用。

工艺路线二：(水提组)称取处方量的冰苓止痒方饮片，以8倍量水为提取溶媒，回流提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至生药量为1 g/mL(1∶1)，放冷后，备用。

1.5 指标性成分定量测定

1.5.1 不同提取工艺路线样品制备 取一定处方生药，按“1.4”项下提取并浓缩备用。

1.5.2 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定落新妇苷、丹皮酚和升麻素苷含量

(1)HPLC色谱条件：色谱柱为INERTSIL ODS-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；以甲醇为流动相A，以0.1% 冰醋酸溶液为流动相B，按表1规定进行梯度洗脱；检测波长：254 nm(升麻素苷)、291 nm(落新妇苷、丹皮酚)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论板数按落新妇苷峰、丹皮酚峰、升麻素苷峰计算分别应不低于5000、3000和2000。

表1 流动相梯度洗脱表

(2)对照品溶液配制：分别取落新妇苷、丹皮酚和升麻素苷对照品适量, 精密称定, 加甲醇共同制成质量浓度分别为568.87 μg/mL、96.10 μg/mL、64.19 μg/mL的对照品溶液, 即得。

(3)样品溶液制备：分别精密移取1 mL“2.1”项下提取液置50 mL锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)样品测定：分别精密吸取对照品溶液10 μL, 样品溶液10 μL, 注入高效液相色谱仪, 测定, 用外标两点法计算, 即得。计算落新妇苷含量(指标A)、丹皮酚含量(指标B)和升麻素苷含量(指标C)。

1.6 药效学实验

皮肤瘙痒是机体自发或受外界影响产生的一种伴随着刮擦行为或欲望的不愉快感觉，4-氨基吡啶具有促肥大细胞释放组胺的作用，其所致小鼠瘙痒模型已被多次应用于测定药物止痒活性的实验中[25]。复方醋酸地塞米松乳膏是长效甾体类激素药物，用于局限性搔痒症、神经性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎以及慢性湿疹。

1.6.1 实验动物分组 SPF级ICR小鼠30只，雌雄各半,体质量(23±2)g，饲养于北京中医药大学动物实验中心，饲养环境温度为(25±2)℃，湿度(50±10)%，适应性喂养后，雌雄各半随机分为5组，分别为空白组、模型组、阳性药组、醇提组、水提组。第4天在小鼠颈背部剪去2 cm×3 cm大小，再用脱毛剂脱毛，24小时后分别给药：用药组分别外涂冰苓止痒提取液适量于脱毛部位，模型组和空白组在脱毛区不作处理，阳性药组外涂复方醋酸地塞米松乳膏适量。30分钟后，每只小鼠颈背部皮下注射0.01% 4-氨基吡啶0.2 mL，空白组注射等量生理盐水，将其置于摄像环境下的观察笼位(50 cm×30 cm×15 cm，由隔板将其分割为6个独立空间)，立即观察10分钟舔体次数(指标D)(小鼠出现反复扭头舔两侧背部的行为，即舔体反应，以小鼠连续舔体致出现短暂停顿，作舔体1次计算)[26]。

1.6.2 制备药物 按“2.1”项下各工艺路线制备每1 mL提取液含1 g生药的药物(临床生药浓度为0.86～1 g/mL)。

1.6.3 动物取材 小鼠的舔体次数记录结束后立即取血，静置至血液分层后以4000 r/分钟的速度离心15分钟分离血清，放置于-20 ℃保存待用，ELISA试剂盒测定小鼠血清中组胺的含量(指标E)。牺牲小鼠后，取注射部位周围皮肤(2 cm×2 cm)全层置于4%多聚甲醛固定液中保存，做石蜡切片并进行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色，观察并比较皮肤组织有无明显的形态学改变，观察真皮中炎细胞的数量及形态学变化[26]。

1.7 统计学方法

1.8 数据标准化处理

数据标准化采用最小—最大标准化处理。对于指标A、B、C，若值越大，则目标值越优，新数据=(原数据-最小值)/(最大值-最小值)。对于指标D、E，若值越小，则目标值越优，新数据=(最大值-原数据)/(最大值-最小值)。

1.9 模糊层次分析法为方案层赋权

1.9.1 构造评价指标层次模型 本实验将评价系统设计为3层，分别为目标层(1级指标，即冰苓止痒喷雾提取工艺路线筛选)、准则层(2级指标，包括化学指标和药效学指标)和方案层(3级指标，包括落新妇苷含量、丹皮酚含量、升麻素苷含量、舔体次数和组胺浓度)。

1.9.2 构造模糊互补判断矩阵 各指标成分的评分标度见表2。比较同一层次指标的相对重要性，构成两两比较模糊互补判断矩阵。

别呦呦没盐了，给了我钱，让我去买，那天逢集，人挤人，一队胡人却从街头疾驰而来。胡人高举长矛，矛尖上挑着血淋淋的首级，有一颗，有两颗，还有人把首级挂在腰带上。人们争相避让，避不及的，就被马踢翻，后面的马跟上来，就把他踩死了，几十匹马风一般掠过，死者都没人形了。街上哭声骂声一片。一个老奶奶是来卖鸡蛋的，一篮子鸡蛋全打了，她没哭一声，只有一头白发在秋风中狂舞；一个卖青菜的中年人就没这么幸运了，他被马踩死了，青菜被人抢光了，只有扁担孤零零地伴着他……

表2 评分数量标度

1.9.3 构造模糊一致矩阵 根据公式(1)(2)转变为模糊一致矩阵R’=(γij)n*n，根据得到的模糊一致矩阵和公式(3)，计算各3级指标权重，得到模糊一致矩阵。

1.9.4 一致性检验 若矩阵检验满足任意指定两行所对应元素之差为常数，则该矩阵为模糊一致矩阵。

2 结果

2.1 HPLC含量测定

采用HPLC法测定指标性成分落新妇苷、丹皮酚和升麻素苷含量的结果见表3。

表3 指标性成分落新妇苷、丹皮酚和 升麻素苷含量(μg/mL，n=2)

2.2 小鼠瘙痒试验

2.2.1 小鼠舔体次数 10分钟内小鼠舔体次数的结果见表4。空白组、水提组、醇提组和阳性药组与模型组相比，均能显著降低舔体的次数，差异有统计学意义，说明4-氨基吡啶致小鼠瘙痒模型造模成功，复方土茯苓方和阳性药对于4-氨基吡啶致小鼠瘙痒模型有一定的抑制作用，其中水提组、醇提组与阳性药组之间相比，均无显著性差异。

表4 不同给药组对小鼠瘙痒舔体次数的影响

2.2.2 ELISA检测血清中组胺含量 在4-氨基吡啶致小鼠瘙痒模型中，组胺是介导瘙痒发生的关键性介质，具有促肥大细胞释放组胺的作用。如表5所示，与模型组相比，空白组小鼠血清中的组胺浓度显著降低，说明瘙痒模型造模成功。与模型组相比，水提组、醇提组和阳性药组小鼠血清中的组胺浓度均显著降低，其中，醇提组的组胺浓度降低最为显著，说明醇提组和水提组对4-氨基吡啶致小鼠瘙痒模型的血清组胺浓度均有一定的降低作用，相比于水提组，醇提组效果更优。

表5 不同给药组对小鼠血清组胺浓度的影响

注：A 空白组；B 模型组；C 阳性药组；D醇提组；E水提组(A、C黄色箭头表示毛囊，红色箭头表示皮脂腺，黑色箭头表示胶原纤维；B蓝色箭头代表坏死细胞，绿色箭头代表新生血管，黑色箭头代表炎症细胞浸润；D、E蓝色箭头代表坏死细胞)。

2.3 数据标准化处理

最小—最大标准化处理后的数据见表6。

表6 标准化数据

2.4 模糊层次分析法为方案层赋权

2.4.1 构造模糊互补判断矩阵 模糊互补判断矩阵见表7。

表7 模糊互补判断矩阵

2.4.2 构造模糊一致矩阵 3级指标的模糊一致矩阵及权重见表8。由表8可知，权重由高到低依次为舔体次数>组胺浓度>落新妇苷含量>丹皮酚含量=升麻素苷含量。

表8 模糊一致矩阵

2.4.3 一致性检验 结果表明，对任意指定的2行其所对应元素之差为常数，该矩阵满足一致性检验。

2.5 各因素指标合成权重的确定

将准则层与3级指标权重相乘，得到各因素相对于总评价目标的总权重，在冰苓止痒喷雾提取工艺路线筛选中，药效学指标比化学成分含量更能代表工艺路线的有效性，故选择药效学指标权重为0.7，指标性成分定量测定占权重0.3。结果见表9。

表9 合成权重及排序

2.6 各工艺路线加权综合得分及排序

结果表明工艺路线一为综合评价优选的最佳提取工艺路线，即全方醇提。结果见表10。

表10 各工艺路线加权综合得分及排序

3 讨论

本实验采用4-氨基吡啶诱导小鼠瘙痒模型，在化学指标上，选取与临床疗效相关的活性成分：新妇苷(君药成分)、丹皮酚(臣药成分)和升麻素苷(君药成分)作为代表冰苓止痒喷雾的有效成分指标，在药效学指标上[25]，选取小鼠舔体次数、血清组胺浓度作为筛选提取工艺路线的指标。结果表明，落新妇苷、丹皮酚和升麻素苷含量高低顺序为工艺一>工艺二，而舔体次数和组胺浓度高低顺序为工艺一<工艺二。基于FAHP得到的评分高低顺序为工艺一>工艺二，小鼠背部皮肤病理切片结果也证实了复方土茯苓方改善皮肤炎症的作用，综上，确立冰苓止痒喷雾的最佳提取工艺路线为全方醇提，可见此工艺路线能最大程度发挥该方的药效物质基础。

美国运筹学家Saaty[27]于1977年提出层次分析法作为一种新的系统分析方法，将定性与定量分析相结合，具有易操作性、实用性和系统性等优点。相比于模糊层次分析法而言，层次分析法构建层次结构的过程较复杂，计算繁琐；在权重的确定上，会受到评价人主观因素的影响[28]。本实验采用模糊层次分析法，将评价系统分为目标层、准则层、方案层，构造模糊互补判断矩阵和模糊一致矩阵，得到权重值并求出各方案的优劣次序。这样既考虑了主观上的影响，又考虑到了各项指标之间的相互联系和影响，具有一定的科学性，为来源于临床经验方的中药复方制剂的提取工艺研究提供新思路与新方法。