华蟾素注射液对Burkitt’s 淋巴瘤细胞Raji体外增殖、凋亡及细胞周期的影响

何宇 王建勋 王佩佩 崔鑫铭 王利

据2020年全球癌症报告数据显示，2020年非霍奇金淋巴瘤全球男性估计新发病例占比为3%，女性为2.6%，男性多于女性[1]。Burkitt’s 淋巴瘤属于非霍奇金淋巴瘤的一种，是一种侵袭性极强的 B 细胞淋巴瘤，多发生于儿童和成年人[2-3]，临床上主要分为地域型、散发型和免疫缺陷相关型三种[4]，Burkitt's 淋巴瘤对化疗药物高度敏感，目前临床治疗仍以多药化疗为主，同时包括靶向治疗、细胞免疫治疗、局部放疗、自体干细胞移植等[5-6]。

中医古籍中并没有淋巴瘤一称，随着时代的发展，医疗的进步，被现代中医学家归为“恶核”“痰核”“阴疽”等范畴，主要表现在“痰、毒、瘀、滞、虚”五个方面[7]，病因病机与邪毒、痰凝等有关，治疗应以解毒散瘀为原则[8-9]。蟾蜍，早在《神农本草经》[10]中便有记载：“蟆，味辛、寒，主邪气，破坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病。”《本草纲目》记载：“蟾蜍，辛、凉、微毒，最良治一切五疳八痢，肿毒，破伤风病，脱肛。”华蟾素注射液便是从蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等蟾蜍干皮经水提醇沉方法得到的水溶性提取物[11]，再加工成注射用灭菌水溶液，具有清热解毒、化瘀溃坚、利水消肿等作用。被广泛用于肝癌、肺癌、胃癌等多种中晚期恶性肿瘤的治疗，但华蟾素注射液对于Burkitt’s淋巴瘤治疗方面少有研究。Raji细胞株于1963年首次从一个11岁小男孩左上颌骨Burkitt’s淋巴瘤中分离而得到的，为B细胞起源，是Burkitt’s淋巴瘤药理学研究的理想选择。基于实验室前期研究方案与方法[12]，因此本实验拟通过观察和检测不同浓度华蟾素注射液对Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji的生物学影响，探讨华蟾素注射液在治疗Burkitt’s淋巴瘤方面的作用效果及相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人Burkitt's 淋巴瘤Raji细胞株(美国ATCC细胞库，编号：CCL-86)；华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批号：211201)；RPMI-1640培养基(美国CORNING公司，批号：34320006)；胎牛血清(美国Gibco公司，批号：2084568P)；1×PBS(美国Gibco公司，批号：8119312)；细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20211210)；膜联蛋白—异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(北京金普来生物科技有限公司，批号：09001); PI/RNase Staining Buffer Solution细胞周期检测试剂(美国BD公司，批号：1228040)。

生物安全柜(美国Thermo Scientific，型号：1300 SERUES A2)；小型台式离心机(德国 Eppendorf，型号：5424R)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Scientific，型号： HERAcell 150i)；倒置显微镜(日本 OLYMPUS，型号：CKX53)；细胞计数仪(美国invitrogen，型号：Countess Ⅱ)；自动酶标仪(美国MolecμLar Devices，型号：SpectraMax i3x)；流式细胞仪 (美国BD，型号：FACSCantoⅡ)；IncuCyte实时动态细胞成像分析仪(美国Essen Bioscience，型号：IncuCyte S3)。

1.2 细胞培养

Raji细胞以5×105个/mL接种于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养于饱和湿度、37℃、5% CO2培养箱内，待其密度达到70%～90%时需要传代，每2～3天传代1次。

1.3 CCK-8法检测华蟾素注射液对Raji细胞增殖的影响

收集处于对数生长期的Raji细胞，每孔4×104个(90 μL)接种于96孔板，各设6个复孔，同时设置空白孔(仅含培养基)及对照孔(含有Raji细胞及培养基)，将华蟾素注射液用10% FBS-RPMI-1640培养基进行稀释，分别为原浓度的1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400，各取10 μL加入至对应实验孔内，总体系100 μL，边缘孔用无菌的PBS溶液进行填充，于饱和湿度、37℃、5% CO2培养箱内培养12小时、24小时、48小时后，尽量避光的条件下加入10 μL CCK-8检测溶液，轻轻振荡混匀，放回培养箱内继续孵育1.5小时,酶标仪波长设置为450 nm，在此波长处读取各孔的吸光度(OD值)，并计算各组细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)× 100%。

1.4 IncuCyte实时动态细胞成像分析系统监测华蟾素注射液对Raji细胞增殖的影响

在实验室前期研究[12]基础上，本实验首次采用IncuCyte实时动态细胞成像分析系统对细胞生长状态进行动态监测与记录。该系统的优势在于不仅可以实时记录活细胞的生长状态，还可以在成像的同时进行定量分析，记录影响细胞生物学行为的关键时间点等。

根据1.4实验结果，取处于对数生长期的Raji细胞，每孔以1×104个(90 μL)的密度接种于96孔板，各设4个复孔，实验组加入10 μL华蟾素注射液稀释液(1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400)，总体系100 μL，空白对照组加入10 μL培养基，实时监测24小时，每隔2 小时拍照一次；以每孔0 h 0 m的汇合度为标准，观察细胞生长情况。

1.5 流式细胞检测华蟾素注射液Raji细胞周期及细胞凋亡的影响

根据1.4实验结果，取处于对数生长期的Raji细胞，每孔以1×106个的密度接种于6孔板，各设4个复孔，选取浓度为原液浓度的1/20、1/50、1/200、1/400的华蟾素稀释液作用于Raji细胞24小时，24小时后显微镜下观察细胞状态。(1)细胞周期实验组：收集细胞于15 mL离心管内，预冷的PBS清洗细胞1次，在涡旋条件下，逐滴加入预冷的70%乙醇1 mL，轻轻吹打混匀，在-20 ℃条件下固定过夜，过夜后离心弃上清，预冷的PBS清洗细胞1次，再使用300 μL PI/RNase Staining Buffer对细胞进行染色, 室温条件下，避光孵育15分钟,用 40 μm滤网过滤细胞至流式管内,1小时内上流式细胞仪检测;(2)细胞凋亡实验组：收集细胞于2 mL离心管内，预冷的PBS清洗细胞1次，加入 100 μL结合缓冲液重悬细胞，每孔加入5 μL Annexin V-FITC抗体；混匀后室温条件下避光孵育15分钟，可在摇床上慢摇加速染色；15分钟后加入10 μL PI；流式上机前在反应管中加入100 μL结合缓冲液终止染色，用 40 μm 滤网过滤细胞，1小时内进行流式细胞检测。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 华蟾素注射液对Raji细胞增殖的影响

不同浓度华蟾素注射液作用于Raji细胞后，12小时、24小时、48小时存活率明显低于空白对照组(1/400实验组的12小时和48小时除外)，并且华蟾素注射液浓度越高，Raji细胞存活率越低，说明抑制率越高，但抑制率与作用时间无明显依赖性，见表1。

2.2 IncuCyte实时动态细胞成像分析系统监测华蟾素注射液对Raji细胞增殖的影响

IncuCyte实时动态细胞成像分析系统监测华蟾素注射液对Raji细胞增殖实验中，不同浓度华蟾素注射液作用于Raji 细胞24小时后，以每孔0 h 0 m的汇合度为标准，通过汇合度变化曲线得出，实验组华蟾素1/10、1/20、1/40、1/50、1/100、1/200、1/400稀释组可明显抑制Raji细胞的增殖，且有统计学差异(P<0.05)，见图1～2，表2。

2.3 华蟾素注射液对Raji细胞周期及凋亡的影响

参考2.1结果，Raji细胞在为原液浓度1/20、1/50、1/200、1/400的华蟾素注射液24小时作用后，通过流式检测其细胞周期及凋亡率的变化情况。结果显示，华蟾素注射液可以增加Raji细胞 G0/G1和S 期的比例，降低G2/M期比例，阻止细胞进入G2/M期，见图3，表3；未经华蟾素注射液处理的Raji细胞自然凋亡率较低，为 (12.65±0.65)%，而经过1/20、1/50、1/200、1/400华蟾素注射液处理24小时后，Raji细胞凋亡率明显升高，分别为(48.15±1.50)%、(33.50±1.51)%、(27.77±1.66)%、(14.72±0.43)%，说明华蟾素注射液能明显诱导Raji细胞的凋亡，且有统计学差异(P<0.05)，见图4，表4。

表1 华蟾素注射液对Raji细胞增殖的影响

注：A 空白对照组0 h 0 m细胞成像图；B 空白对照组24 h 0 m细胞成像图；C 华蟾素1/20 稀释组0 h 0 m细胞成像图；D 华蟾素1/20 稀释组24 h 0 m细胞成像图；E 华蟾素1/200 稀释组0 h 0 m细胞成像图；F 华蟾素1/200 稀释组24 h 0 m细胞成像图。

注：以每孔0 h 0 m汇合度为标准，IncuCyte实时动态细胞成像分析系统获取的各组汇合度变化曲线。

表2 IncuCyte实时动态细胞成像分析系统监测不同稀释倍数华蟾素注射液对Raji细胞增殖的影响

表3 不同稀释倍数华蟾素注射液对Raji细胞周期的影响

注： 横坐标代表Annexin V-FITC，纵坐标代表PI；Q1代表损伤或坏死细胞，Q2代表晚期凋亡的Raji细胞，Q3代表Raji活细胞，Q4代表早期凋亡的Raji细胞。

表4 不同稀释倍数华蟾素注射液 对Raji细胞凋亡的影响

3 讨论

《中医大辞典》中记载：“蟾蜍，辛，凉，有毒，有解毒消肿、止痛、利尿的功效。”蟾蜍作为我国传统的抗肿瘤中药材，因其药效显著而被广泛研究。华蟾素注射液作为中国自行研发制作的中药二类新药，自上世纪80年代上市至今，在临床应用已有40余年[13]，华蟾素注射液化学成分较为复杂，截至目前已分离获得单体化合物超过100种[14]，主要包括蟾蜍二烯羟酸内酯类、小分子肽类、生物碱类及有机酸类等[15]。多项研究表明，蟾蜍二烯羟酸内酯和吲哚生物碱两大类具有抗肿瘤的作用[16]。大量临床研究表明，华蟾素注射液与化疗药物联用可有效降低化疗药物的不良反应，安全性较好，可提高患者的生活质量[17-19]。

现代药理学研究表明，华蟾素注射液可通过诱导细胞凋亡对肝癌、肺癌、胃癌等多种实体瘤发挥抑制作用[17，19-21]。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，能有效地清除机体内受损的细胞。细胞凋亡的失调不仅与肿瘤的发生发展有关，而且与肿瘤对治疗的抵抗有关[22]。根据先前的研究结果，华蟾素注射液一方面可通过调控肝癌细胞中Bcl-2/Bax和Fas/Fas L的表达，诱导细胞启动凋亡程序，抑制肝癌细胞的增殖[23]；还可通过调控miR-106a-5p/STRT3信号通路促进凋亡发生[24]。本实验中，CCK-8法、IncuCyte活细胞成像以及流式检测均发现，华蟾素注射液可有效抑制Raji细胞的增殖，促进其凋亡，且药物浓度越高，作用效果越明显。并且首次应用IncuCyte动态监测系统还直接观察到，在华蟾素注射液干预6小时后，Raji细胞的增殖明显受限，图像显示细胞呈皱缩状态。

细胞周期由一系列的检验点控制，当DNA出现损伤时，可激活相关的检验点蛋白，从而导致细胞周期的延迟或阻滞[25]，细胞周期的异常可直接影响肿瘤细胞的增殖与分化。Han Y等[26]研究发现，华蟾素联合吉非替尼可将A549细胞周期阻滞于S期。张霞等[27]实验表明，华蟾素注射液可阻滞Hep G2肝癌细胞于G0/G1期。本实验中，流式检测及分析发现，与空白对照组相比，不同浓度华蟾素注射液可阻滞Raji细胞周期于G0/G1期和S期，表明华蟾素注射液可能通过抑制Raji细胞周期发挥抗肿瘤作用。

综上，本研究首次证实华蟾素注射液可抑制Burkitt's 淋巴瘤Raji细胞的增殖，促进其凋亡，阻滞细胞于G0/G1期和S期，发挥其抗肿瘤作用，为临床治疗Burkitt's 淋巴瘤提供新的思路及客观的体外实验依据。后续研究可针对华蟾素注射液单体成分的作用效果、对Raji细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达及信号通路的影响进行研究，进一步明确华蟾素注射液治疗Burkitt's 淋巴瘤的作用机制。