防风多糖温敏凝胶的制备及评价

高艳艳 秦铭 徐广 吉莉 郭宇瑛 李颜伶 马群

防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.为伞形科植物防风的干燥根，味辛、甘，性微温，归膀胱、肝、脾经[1]。临床上防风为治疗湿疹、荨麻疹、特异性皮炎等过敏性疾病引起皮肤瘙痒的首选药。防风多糖是防风重要的活性成分，具有抗肿瘤、抗癌、抗菌、免疫调节等多种药理作用[2-4]。目前关于防风多糖的研究主要集中在单糖组成[5-6]、抗氧化[6-7]、抗肿瘤[3]等方面，抗过敏作用的物质基础研究及新剂型的研发较少。

温敏凝胶剂是以溶液状态给药后，利用高分子材料对外界温度的响应发生相转变，由液态转化为非化学交联半固体凝胶的制剂[8]。温敏凝胶剂给药后能粘附于给药部位，使局部药物浓度升高，达到并维持有效药物浓度。其具有作用时间长，避免首关效应，减少毒副作用[9]等特点。普通凝胶给药时需要人为的涂抹，使用存在一定的不便，而且给药时容易损伤皮肤，造成二次损伤，对于大面积创伤难以保证给药均匀，而温敏凝胶能有效避免此类情况发生，尤其适合做各种中药提取物的给药载体[10-11]。

随着中药外用制剂的不断发展，“内病外治”已成为今后研究发展方向之一。课题组前期研究表明防风多糖具有较好的抗过敏活性，本研究将防风有效部位制备成温敏凝胶，使药物直接作用于病变部位并维持较高的血药浓度，延长作用时间。药物释放与凝胶溶蚀同时进行，更好地发挥缓释作用，且解决了普通凝胶分散不均匀问题，提高患者顺应性，提高药物的生物利用度，为临床外用缓释制剂的制备提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

防风(北京三和药物有限公司)，称取防风切片600 g置于圆底烧瓶中，加入10倍量蒸馏水，加热回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液。提取液浓缩至生药含量1 g/mL时进行醇沉，乙醇终浓度为80%，于4℃静置12小时滤去上清液，取沉淀干燥，得防风粗多糖。采用Sevage法除蛋白，采用大孔树脂法除色素，得到防风多糖。

泊洛沙姆407(GND32821B)、泊洛沙姆188(GNE03221B)，购自德国BASF公司；甘油(批号：20150328)、丙二醇(批号：20130612)，购自北京化工厂；苯甲酸(批号：20120910)，购自天津市福晨化学试剂厂；葡萄糖对照品(批号：B21882)、薄荷油(批号：S24778)、山梨醇(批号：S11057)，购自上海源叶生物科技有限公司；氮酮(批号：XW00503391)、聚乙烯吡咯烷酮K30(批号：30154481)，购自国药集团化学试剂有限公司；对羟基苯甲酸甲酯(批号：20150613)， 购自天津市光复精细化工研究所。

万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52AA)；恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司，型号：HH-S6)；超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-400KDE)；台式离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-50B)；实验室用pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，型号：FE20)；双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司，型号：TU-1901)；RTC Basic磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司，型号：IKA)；SPECTRO star Nano酶标仪(德国BMG LABTECH公司，型号：DNM-9602)；恒温振荡器(常州金坛良友仪器有限公司，型号：ZD-85)。

1.2 温敏凝胶的制备工艺

采用冷凝法制备温敏凝胶。精密量取一定量纯化水，加入准确称量的泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)，放入4℃冰箱至充分溶胀，得澄清透明的空白原位凝胶。取适量防风多糖样品加入凝胶基质中，混合均匀，制得防风多糖温敏凝胶剂。

1.3 胶凝温度的测定

取适量温敏凝胶于烧杯中，磁力搅拌器设置转速为200转/分钟，以1～2℃/分钟的速率缓慢升温，观察溶液状态变化，直至烧杯倒置后溶液不再流动，此时温度定义为胶凝温度(T)，测定3次取平均值。

1.4 单因素试验

1.4.1 凝胶基质筛选 (1)P407浓度对胶凝温度的影响：配制浓度为15%～25%的P407溶液，按“1.3”项下方法测定其胶凝温度，每种浓度测定3次，取平均值。(2)P188浓度对胶凝温度的影响：配制浓度为40%～80%的P188溶液，按“1.3”项下方法测定其胶凝温度，每种浓度测定3次，取平均值。(3)P407与P188浓度对胶凝温度的影响：根据上述考察结果，固定P407浓度(16%、18%、20%)，分别向其中加入不同浓度的P188(0.5%～5%)，按“1.3”项下方法测定其胶凝温度，每种浓度测量3次，取平均值。

1.4.2 多糖加入对基质胶凝性质的影响 以含2%多糖的P407/P188(20%/1%)凝胶溶液考察制剂配制方式，方法如下：A多糖用足量蒸馏水使完全溶解，将基质加入多糖水溶液中，置4℃冷藏24小时，使其完全溶胀；B将基质加入足量蒸馏水中，置4℃冷藏24小时，使完全溶胀，再将多糖加入空白基质溶液中。按“1.3”项下方法测定其胶凝温度。

1.5 Box-Benhnken法优化温敏凝胶制备工艺 在单因素试验的基础上，选择P417、P188、PVP-K30、甘油的浓度作为考察因素，胶凝温度作为响应值，采用Box-Benhnken设计法进行处方优化，范围分别为：P417浓度(A)为16%～24%，P188浓度(B)为1%～5%，PVP-K30浓度(C)为0.1%～0.5%，甘油浓度(D)为1%～10%。对结果进行多元回归拟合，以胶凝温度30～32℃为拟合范围得到最优处方。

1.6 质量评价

1.6.1 含量测定 精密称取防风多糖温敏凝胶50 mg于25 mL容量瓶中，加适量水超声15分钟后定容至刻度。制备3批样品采用苯酚-硫酸法测定总多糖含量，具体操作参照2020版《中华人民共和国药典》[12]。

1.6.2 外观性状 取制备的适量防风多糖温敏凝胶分别在室温条件下与31℃左右的皮肤表面观察凝胶的性状。

1.6.3 pH值 称取适量防风多糖温敏凝胶3份置于西林瓶中，用pH计测定其pH值，每份测量3次取平均值。

1.6.4 黏度 称取防风多糖温敏凝胶3份置于西林瓶中，用NDJ-8S黏度计4号转子测定其黏度，每份测量3次取平均值。

1.6.5 稳定性 (1)一般稳定性试验：取防风多糖温敏凝胶3份，将其置于4℃、25℃、40℃环境下一周，分别于第1、4、7天取样观察，以温敏凝胶的外观性状、含量、pH为指标，考察其稳定性。(2)耐热耐寒试验：将防风多糖温敏凝胶剂分别置于6个具塞试管中，其中3份置60℃恒温干燥箱中6小时，另3份置-20℃冰箱中24小时，观察凝胶的外观变化。(3)离心试验：取防风多糖温敏凝胶3份置于离心管中，3000 r/分钟，离心30分钟，观察其外观变化、均匀程度以及是否分层。

1.6.6 溶蚀动力学与释药行为考察 采用无膜溶出法测定温敏凝胶的溶蚀动力学，并考察药物的释放。精密称取防风多糖温敏凝胶5 g，加入到质量为W0的具塞试管中，置于37℃恒温振荡器中预热10分钟，完全形成半固体凝胶后称重W1。加入5 mL同温度pH=7.2的PBS缓冲液，振动频率为100 r/分钟，每隔30分钟倾倒出全部释放介质另存，将试管表面拭干，迅速称量并记录其质量为Wt。缓慢补加同温度释放介质5 mL，放入恒温振荡器中继续上述操作，直至试管内溶液全部倒出，相邻时间点间质量差异即为凝胶累积溶蚀率，计算公式为Q(%)=W1-Wt)/(W1-W0)×100%。以凝胶累积溶蚀率对取样时间作图，得到凝胶经时溶蚀曲线。另外，取上述另存的释放介质，按“1.6.1”项下方法测定防风多糖含量，以累积释药率对取样时间作图，得到凝胶释药曲线。

2 结果

2.1 单因素实验

2.1.1 凝胶基质筛选 P407浓度对胶凝温度影响显著，如图1所示，当P407浓度在15%～25%之间时，随着P407浓度升高，胶凝温度呈下降趋势，表明胶凝温度对P407浓度的大小有依赖性。如图2所示，当P188浓度在40%～80%之间时，随着P188浓度升高，胶凝温度呈下降趋势，浓度80%时，胶凝温度在30℃左右才符合皮肤给药温度。由图3可知，当P407的浓度一定时，胶凝温度随着P188浓度(0.5%～5%)的增大而升高。因此，本实验将P407与P188两种基质联合使用，调节温敏凝胶皮肤给药的最适温度。

图1 不同浓度P407对胶凝温度的影响(n=3)

图2 不同浓度P188对胶凝温度的影响(n=3)

图3 不同浓度的P407与P188对胶凝温度的影响(n=3)

2.1.2 多糖加入对基质胶凝性质的影响 如表1所示，多糖的加入对温敏凝胶胶凝温度影响较小。根据凝胶外观及胶凝温度的变化，选择B项加入方式。

表1 多糖加入对基质胶凝性质的影响(n=3)

2.2 Box-Benhnken法优化温敏凝胶处方

采用Box-Benhnken试验来考察关键工艺参数与工艺优化指标之间的相互关系，进行处方优化。结果表明P407、P188、PVP-K30、甘油浓度、P407浓度和甘油浓度的交互作用对温敏凝胶的胶凝温度都有显著影响。结果见表2。

采用Design-Export 8.0软件进行多元线性回归拟合，得到二次多项式模型的回归方程Y=36.18-10.74×A+4.28×B+2.51×C+2.14×D+1.23×A×B-0.15×A×C-3.10×A×D-1.37×B×C-0.52×B×D-0.35×C×D+0.13×A2-2.29×B2+0.46×C2+0.41×D2。对该数学模型进行方差分析，结果见表3，P<0.0001，说明二次多项式模型显著性良好，该模型拟合程度良好，可以为温敏凝胶处方组成提供参考。由该模型预测的处方组成为P407浓度19.4%，P188浓度1.4%，PVP-K30浓度0.1%，甘油浓度6.0%，胶凝温度约为30.5℃。

表2 Box-Benhnken设计和结果

2.3 防风多糖温敏凝胶的质量评价

2.3.1 含量测定 采用苯酚—硫酸法测定防风温敏凝胶中总多糖含量，结果见表4。

2.3.2 外观性状 常温下，防风多糖温敏凝胶为质地均匀的黄棕色液体。加热到31℃时，液体逐渐转变为半固体物质，质地均匀细腻，有一定黏度，涂展性良好。如图4所示。

表3 以胶凝温度为响应值的 回归模型方差分析表

表4 防风多糖温敏凝胶总多糖含量测定结果

2.3.3 pH值 防风多糖温敏凝胶的pH为5.41，符合外用凝胶剂的pH要求。

2.3.4 黏度 防风多糖温敏凝胶的黏度测量结果见表5，均值为344143 mPa·S。

表5 防风多糖温敏凝胶黏度测定结果

2.3.5 稳定性 (1)一般稳定性：如表6所示，防风多糖温敏凝胶在3种环境下未发现外观形态改变，pH与含量无明显变化。(2)耐热耐寒稳定性：防风多糖温敏凝胶外观未发生变化，未分层沉降，质地均匀。(3)离心试验：防风多糖温敏凝胶外观未发生变化，未分层，质地均匀。

表6 不同温度下防风多糖温敏凝胶的稳定性

2.3.6 溶蚀动力学与释药行为考察 温敏凝胶溶蚀曲线和释药曲线如图5和图6所示。结果表明，其释放具有时相性，前期释药稍快，后期释药则有明显的缓释特征，释放时间可达18小时以上。初步分析防风多糖温敏凝胶体外释药特征为缓释释放。以累积溶蚀率为横坐标(X)，累积释放率为纵坐标(Y)，进一步考察凝胶溶蚀与药物释放的相关性，得到其回归方程Y=0.9592X+1.1145，R2=0.9986。以上结果表明，药物释放与凝胶溶蚀是同时进行的，药物释放速率主要受到凝胶溶蚀的控制。

图5 防风多糖温敏凝胶体外溶蚀曲线(n=3)

图6 防风多糖温敏凝胶体外释药曲线(n=3)

3 讨论

经皮给药是指药物运用到皮肤后，通过角质层经毛细血管吸收使该处的药物浓度升高，达到并维持有效浓度，具有局部或全身治疗作用[13]。中药经皮给药有多种剂型，乳膏剂、软膏剂、散剂、涂剂等传统外用制剂存在载药量小、生物利用度低、污染衣物等缺陷，且手工制备剂量不精确、工艺粗放，无法满足高质量中药制剂的需求[14]。温敏凝胶在局部给药方面具有独特优势，其可以提高药物的溶解度及稳定性，且直接作用于病变部位，具有缓释、控释功能，生物利用度高，患者顺应性好，近年来逐渐应用于中药新剂型开发。本研究采用P407和P188作为凝胶基质，制备工艺简单、靶向性强，且具有一定的表面活性能增加难溶药物的溶解度[15]，克服了以壳聚糖为基质制备的凝胶胶凝温度难控制、胶凝时间过长的缺点，而且相较于以N-异丙基丙烯酰胺为基质制备的凝胶，对皮肤无刺激性。

防风多糖是多种生物活性的重要物质基础[16]，在防治过敏疾病方面有潜在的优势。课题组前期使用二硝基氟苯诱导小鼠迟发型超敏反应，通过耳肿胀率、体质量和器官重量等指标评价防风多糖的抗过敏能力，结果表明防风多糖能有效的抑制小鼠迟发型超敏反应，具有抗过敏的作用[17]。然而，中药成分的添加可能会影响制剂的稳定性。因此，本研究比较2%、4%、6%、8%不同比例的多糖加入对基质胶凝性质的影响，2%、4%、6%比例的多糖加入后溶解完全得澄清液体，8%多糖加入后溶液载药量饱和，有多糖析出。2%、4%、6%多糖加入后胶凝温度分别为30.5℃、30.8℃、30.7℃，证明多糖的加入对温敏凝胶胶凝温度和性质影响较小，所制备的防风多糖温敏凝胶性质稳定。

防风多糖温敏凝胶用于治疗过敏性疾病，其溶蚀作用与药物释放机制和治疗效果息息相关，通过研究药物浓度与消除规律，可有效评价制剂优劣和指导用药。由体外溶蚀曲线和释药曲线可知，在初始阶段防风多糖释放速率较快，随着释放时间的延长，防风多糖释放速率逐渐减慢，曲线斜率接近于零，表明防风多糖温敏凝胶药物释放达到平衡。主要原因是随着时间的延长，温敏凝胶内部的防风多糖向介质中不断扩散，温敏凝胶表面和药物介质中的药物浓度梯度逐渐降低，使药物释放速率减慢，由此表现出缓释的效果。

本论文制备的防风多糖温敏凝胶工艺稳定，外观均匀，质量可控且有较好缓释作用，可为临床治疗过敏性疾病提供新型药物，为防风新剂型的开发提供参考。温敏凝胶剂作为一种新型的外用制剂，工艺简单，工业化生产较为便利，生物利用度高，患者适应性好，适合中药制剂的应用现状，有利于推广，可作为中药传统制剂剂型改进的一种选择。但凝胶剂载药量小，仍存在一定的局限性，可应用脂质体、微囊、微乳、包合物等新技术使中药凝胶剂所含药物发挥更好的药效。