miR-370对肺癌细胞增殖、迁移活力的调节作用及分子机制研究

韩春全 黄 琼

(漳州市第三医院肿瘤内科 漳州 363000)

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，发病率、死亡率均呈明显上升趋势[1-2]，虽然手术切除、放化疗、靶向药物等综合治疗的开展使患者的生存时间得以延长，但多数患者会因为基因突变而出现耐药性、进而影响疗效及预后。因此，寻找新的治疗靶点是肺癌相关研究的关注热点。微小RNA(microRNAs，miRs)是一类在转录后水平调节基因表达的小分子RNA，在多种恶性肿瘤的发生发展中起到不同作用。刘馨[3]的研究报道，肺癌组织中miR-370的表达显著下调，EGFR的表达显著上调且miR-370与EGFR的表达具有负相关关系，进一步的双荧光素酶实验证实miR-370能够与EGFR基因3’UTR结合，表明miR-370能够靶向抑制EGFR的表达。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，在肺癌的发生发展过程中能够刺激癌细胞的增殖、迁移[4-7]，但miR-370是否通过靶向EGFR抑制肺癌细胞的增殖、迁移尚未明确。为此，本实验将以肺癌A549细胞株为对象，具体分析miR-370靶向EGFR调控癌细胞增殖、迁移的作用及机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞

肺癌A549细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2试剂

miR-370 mimic、阴性对照(NC)mimic购自上海吉玛制药技术有限公司，EGFR质粒、空白质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，miRNA提取分离试剂盒、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，细胞增殖活力MTS法检测试剂盒购自Promega公司，EGFR的单克隆抗体购自Abcam公司。

1.1.3仪器

荧光定量PCR仪购自Bio-rad公司，酶标仪购自Bio-tek公司，显微镜购自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及分组

A549细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中贴壁培养，常规消化传代后接种在培养板中并分组干预，方法如下：对照组用不含mimic、质粒的DMEM处理，NC mimic组转染NC mimic、miR-370 mimic组转染miR-370 mimic，空白质粒组转染空白质粒，空白质粒+miR-370 mimic组同时转染空白质粒和miR-370 mimic，EGFR质粒+miR-370 mimic组同时转染EGFR质粒和miR-370 mimic。

1.2.2miR-370表达的检测

传代后的A549细胞接种在12孔培养板中，按照方法1.2.1部分分组干预48h，弃去培养基、保留细胞，采用miRNA提取分离试剂盒分离细胞中的miRNA，采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒将miRNA反转录为cDNA，采用miRNA荧光定量检测试剂盒配置PCR反应体系并进行PCR扩增，分别扩增miR-370及U6，根据扩增曲线计算miR-370的表达水平。

1.2.3细胞增殖活力的检测

传代后的A549细胞接种在96孔培养板中，按照方法1.2.1项下分组干预48h，采用MTS法检测细胞增殖活力，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上检测490nm波长的吸光值、记为OD490。

1.2.4细胞迁移活力的检测

传代后的A549细胞接种在12孔培养板中，用黄枪头在细胞板底部中央做一划痕，在显微镜下观察划痕、拍照记录并计算划痕面积A0；按照方法1.2.1部分分组干预48h，在显微镜下观察划痕、拍照记录并计算划痕面积A24，按照(A0-A24)/A0计算相对愈合面积。

1.2.5EGFR表达的检测

传代后的A549细胞接种在12孔培养板中，按照方法1.2.1项下分组干预48h，弃去培养基、保留细胞，采用RIPA裂解液提取细胞中的蛋白并测定蛋白含量，取30μg蛋白进行western blot检测，先进行电泳，而后电转移至NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭NC膜1h，1∶1000稀释的EGFR单克隆抗体4℃孵育NC膜过夜；次日，1∶1000稀释的HRP二抗室温孵育NC膜1h，最后显影得到蛋白条带，根据条带的灰度值计算表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0统计学软件进行数据处理，3组间计量资料的比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-370 mimic对A549细胞中miR-370表达的影响

转染miR-370 mimic后，miR-370 mimic组A549细胞中miR-370的表达水平明显高于对照组及NC mimic组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组A549细胞中miR-370表达的比较

2.2 miR-370 mimic对A549细胞增殖活力的影响

转染miR-370 mimic后，miR-370 mimic组A549细胞的OD490水平明显低于对照组及NC mimic组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 3组A549细胞OD490水平的比较

2.3 miR-370 mimic对A549细胞迁移活力的影响

转染miR-370 mimic后，miR-370 mimic组A549细胞的相对愈合面积明显低于对照组及NC mimic组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表3。

图1 3组A549细胞的划痕图像

2.4 miR-370 mimic对A549细胞EGFR表达的影响

转染miR-370 mimic后，miR-370 mimic组A549细胞中EGFR的表达水平明显低于对照组及NC mimic组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、表4。

图2 3组A549细胞EGFR的蛋白电泳图

表4 3组A549细胞中EGFR表达水平的比较

2.5 过表达EGFR对miR-370 mimic调节A549细胞增殖、迁移的影响

与空白质粒组比较，空白质粒+miR-370 mimic组A549细胞的OD490水平、相对愈合面积明显降低(P<0.05)；与空白质粒+miR-370 mimic组比较，EGFR质粒+miR-370 mimic组A549细胞的OD490水平、相对愈合面积明显增加(P<0.05)，见表5。

表5 3组A549细胞OD490水平、相对愈合面积的比较

3 讨论

miRs是具有广泛生物学功能的非编码小分子RNA，能够在转录后水平抑制靶基因的表达并产生相应的生物学效应。近年来，miRs在恶性肿瘤发生发展中的作用受到了越来越多关注，靶向原癌基因的miRs能够发挥抑癌作用、靶向抑癌基因的miRs能够发挥促癌作用，增加抑癌miRs表达或减少促癌miRs表达成为了治疗恶性肿瘤的新靶点[8-10]。

miR-370是一种具有抑癌作用的miR，已有研究报道，miR-370对结肠癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞的增殖及迁移具有抑制作用[11-14]。国内刘馨[3]的研究报道，肺癌组织中miR-370的表达显著下调，提示miR-370能够在肺癌的发生发展中起到抑癌作用，但国内尚无miR-370直接调控肺癌细胞增殖、迁移的相关基础研究。本实验选择肺癌A549细胞是实验对象，经荧光定量PCR证实转染miR-370 mimic能够增加细胞中miR-370的表达后，进一步观察了细胞的增殖活力和迁移活力。经MTS发生测定增殖活力可知：增加miR-370表达能够抑制A549细胞的增殖；经划痕实验测定迁移活力可知：增加miR-370表达能够抑制A549细胞的迁移。以上结果表明，miR-370对肺癌细胞的增殖和迁移具有抑制作用，与其在肺癌组织中低表达的趋势吻合，说明miR-370在肺癌的发生发展中起抑癌作用。

国内刘馨的研究对miR-370的靶基因进行了初步探究，该研究通过双荧光素酶报告基因的检测证实miR-370靶向结合EGFR基因的3'UTR。EGFR在肺癌细胞的增殖、迁移中均起到促进作用，miR-370靶向EGFR的作用与其抑制肺癌细胞增殖、迁移的作用吻合。本实验在刘馨的研究基础上观察了miR-370在肺癌细胞中调控EGFR表达的作用，在增加miR-370的表达后，A549细胞中EGFR的表达水平明显降低，说明miR-370能够抑制肺癌细胞中EGFR的表达，与既往研究报道miR-370靶向EGFR基因3'UTR的结果吻合。在此基础上，本实验还设计了表达EGFR的质粒，在转染miR-370 mimic的同时也转染了表达EGFR的质粒，在增加EGFR的表达后、miR-370抑制A549细胞增殖及迁移的作用发生了逆转，由此证实miR-370通过靶向抑制EGFR表达的方式抑制肺癌细胞的增殖和迁移。

综上所述，miR-370能够降低肺癌细胞的增殖、迁移活力，抑制EGFR表达是miR-370发挥上述作用的分子机制之一。