103个mcr质粒的结构与特征

唐 标，常 江，2，胡 骥，钱鸣蓉，夏效东，杨 华，*

(1.浙江省农业科学院 a农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，b农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 2.上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240； 3.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

日益严重的细菌耐药性是公共卫生安全的重要威胁[1-3]，特别是超广谱β-内酰胺酶 (ESBL)和碳青霉烯酶的出现给医院感染的治疗带来了挑战[4-6]。黏菌素是治疗碳青霉烯类耐药菌感染的最后一线药物之一[7-9]。以往认为黏菌素的抗性由染色体介导，且不易水平传播。直到2015年11月，华南农业大学和中国农业大学团队在来自食品动物和临床患者的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等中检测到一种新的由质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1[8]。携带mcr-1基因的质粒具有接合转移能力，有助于黏菌素耐药性稳定持久的传播。随后，许多国家陆续报道了携带mcr-1基因质粒的革兰氏阴性菌，这些菌对公众健康造成了重大威胁[10-16]。目前质粒的报道主要集中在质粒草图水平上，侧重于mcr基因的基因环境分析，质粒的完成图报道占比相对较少[17]。近年来，黏菌素在畜禽养殖中作为促生长药物被禁用[18]，动物源细菌对黏菌素的耐药率随之持续下降，但是耐药率仍维持在5%[19]。本文对携带mcr基因的质粒完成图和相关耐药基因进行了系统的回顾，共分析了2015—2018年GenBank收录的103个完整的质粒序列，对mcr及其在质粒上的共存基因进行总结，这有助于深入了解黏菌素耐药性持久传播的原因。

1 质粒图谱

2015—2018年公布的103个携带mcr-1基因的质粒分布在五大洲的20个国家。其中，从中国不同样本中分离到51个质粒，占总数的49.5%(图1)。这些质粒存在于6种菌株中，其中多为肠杆菌科(图2)，大肠埃希菌占76.7%，沙门氏菌占8.7%。这些质粒的长度介于15～260 kb，60 kb的质粒占比最高(图3)；最大的是质粒p100R(NCBI登录号：KY689633)，达256 260 bp[20]；最小的是未命名的质粒unamed1(NCBI登录号：KX528699)，为15 998 bp[21]。这些质粒至少可以划分为7种不同的复制子类型，包括IncHI2、IncHI1A、IncN、IncFII、IncI2、IncX4、IncP1，与Wang等的报道一致[22]，其中IncI2占比最高，为50.5%；其次为IncX4，占比为24.3%。IncHI2类型的质粒较大，通常在200 kb左右[23]；IncX4质粒大小为33 kb左右[24-25]。质粒复制子类型与多重耐药菌株、细菌性疾病暴发有密切关系[26]。mcr质粒复制子类型以IncI2和IncX4为主，推测这2种类型质粒更能适应宿主传播。IncHI2质粒容易携带多重耐药基因，我们之前对携带mcr-1的IncHI2质粒进行的比对研究，也发现了该类型质粒有多重耐药基因可变区[10]。IncX4质粒比较保守，结构没有变化，仅有SNP差异[10]。

图1 103个携带mcr基因质粒的地域来源Fig.1 Geographical origin of 103 plasmids carrying mcr gene

图2 103个携带mcr基因质粒的宿主Fig.2 Hosts of 103 plasmids carrying mcr gene

图3 103个携带mcr基因质粒的复制类型分布Fig.3 Distribution of replication type of 103 plasmids carrying mcr gene

2 质粒耐药基因

通过resfinder软件分析[27]发现，共25个质粒携带其他获得性耐药基因，每个质粒平均有6.52个耐药基因。其中pHNSHP45-2(NCBI登录号：KU341381)[9]的耐药基因最多，有16个；其次是pXGE1mcr(NCBI登录号：KY990887)[28]、p100R(NCBI登录号：KY689633)[20]和pEC2-4(NCBI登录号：CP016184)，均有15个耐药基因，pMR0516mcr(NCBI登录号：KX276657)[29]和pECJS-59-244(NCBI登录号：KX084394)[30]质粒均有14个耐药基因(图4)。pHNSHP45-2的耐药基因包括β-内酰胺类(blaCTX-M-14)、氟苯尼考(floR，cmlA1)、磺胺类(sul1、sul2、sul3)、氨基糖苷类[aadA1、aadA2、aph(3′)-Ia、aac(3)-Iva、aph(4)-Ia]、氟喹诺酮(oqxA、oqxB)、磷霉素(fosA3)和甲氧苄啶(dfrA12)等；质粒pXGE1mcr(NCBI登录号：KY990887)上存在β-内酰胺类(blaCTX-M-14)、氟苯尼考(floR，cmlA1)、磺胺类(sul1、sul2、sul3)、氨基糖苷类[aadA1、aadA2、aph(3′)-Ia、aac(3)-Iva、aph(4)-Ia]、磷霉素(fosA3)、甲氧苄啶(dfrA12)、MLS[大环内酯类、林可酰胺类和链霉菌素B，mph(A)][28]等耐药基因。

在所有多重耐药质粒中共预测到35种耐药基因，能够介导10种耐药表型(图5)。除黏菌素外，以上103个质粒上β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类耐药基因共存的数量最多，分别为18个、15个和13个。具体到基因来看，除了mcr基因，携带sul3和aadA1基因的质粒数量最多，均为11个(图6)。黏菌素和碳青霉烯类抗生素是临床治疗肠杆菌科感染的最后一线药物，而值得注意的是IncX4型质粒pCQ02-121(NCBI登录号：KU647721)同时携带了碳青霉烯类耐药基因blaNDM-5，因此具有较大的公共卫生安全风险。

图5 103个mcr质粒所携带耐药基因介导的耐药表型Fig.5 Drug resistance phenotypes mediated by 103 plasmids carrying mcr gene

图6 103个mcr质粒所含耐药基因数量Fig.6 Numbers of antimicrobial resistance genes in 103 plasmids carrying mcr gene

3 抗消毒剂和抗重金属基因

基于BacMet数据库[31]分析发现，编码抗消毒剂和抗重金属的基因在以上103个质粒中分布广泛。预测结果表明，95.14%的质粒含有抗消毒剂和重金属抗性基因，例如抗三氯生(Triclosan)基因triA-triC、oqxB，抗十二烷基磺酸钠基因ydeO，抗西曲溴铵(Cetrimide)基因qacF，抗铜基因dsbC，抗汞基因merA，抗锰基因sitA-sitC，抗碲基因terA-terC、terW、terZ等。不同质粒上含有的抗性基因数量分布不均等。在所有检测到的抗性基因中，碲和三氯生抗性基因占预测总抗性基因的93%以上。此外，有些质粒存在多个抗性基因(图7)，例如，质粒pICBEC72Hmcr(NCBI登录号：CP015977)携带多个三氯生抗性基因[32]，质粒pSA26-MCR-1(NCBI登录号：KU743384)携带多个碲抗性基因[33]，质粒pMR0516mcr(NCBI登录号：KX276657)携带抗锰、铁和过氧化氢的基因簇等。

4 可移动元件与接合转移能力分析

可移动元件是驱动获得性耐药基因在人和动物中传播的重要因素[34]。插入序列通过ISfinder进行预测[35]，在所有质粒中共检测到35种转座子或插入序列(图8)，表明这些质粒的耐药基因具有传播到其他细菌的潜力[36]。其中，在38个质粒中检测到ISApl1和IS26，占比均为37.9%。据报道，ISAspl1对mcr-1的传播有重要影响[37]。从此次分析结果来看，IS26在以上质粒中出现的概率较高。IS26是一种常见的转座酶，与细菌耐药性具有较强的相关性[38]，并在获得抗生素耐药性中发挥作用，其在黏菌素耐药性传播中的作用有待进一步研究。使用oriTfinder预测[39]发现，在103个携带mcr基因质粒中，18.45% (19/103)具有完整的IV型分泌系统转移元件，包括接合质粒的转移位点(oriT)、松弛酶(relaxase)、耦联蛋白(T4CP)和T4SS，表明其具有较强的接合转移能力[39-40]。最先报道的IncHI2型质粒pHNSHP45-2包含完整的接合转移元件，且至今仍不断分离检测到该类型的mcr-1基因携带质粒，这表明其传播mcr-1基因和其他抗性基因的风险较高[41-42]。从本研究结果来看，多数质粒都具有oriT区域，表明这些质粒具有潜在的接合转移能力，是促进黏菌素耐药性传播的危险因素。可移动元件能够携带耐药基因造成水平转移，并可以跨种属传播；而接合转移是完整质粒向其他细菌发生的滚环复制现象，往往发生在种间或属间。综上，mcr质粒具有丰富的可移动元件和接合转移元件，在选择压力下，较容易发生传播和变异。

图7 103个mcr质粒所携带的消毒剂和重金属抗性基因数量Fig.7 Numbers of antibacterial biocide and heavy metal-resistance genes in 103 plasmids carrying mcr gene

图8 103个mcr质粒中的可移动元件数量Fig.8 Numbers of mobile elements in 103 plasmids carrying mcr gene

5 讨论与展望

本研究采用系列生物信息学预测来描述携带mcr及其相关基因且具有完成图的质粒的基本特征，预测了可能影响黏菌素耐药性传播的质粒共性因素。在耐药基因中，sul3、aadA1、aadA2、tet(A)与黏菌素抗性基因mcr有很高的共存率；在耐药基因型上，携带mcr-1的多重耐药质粒对β-内酰胺类抗生素有较高的耐药率。这与以上抗生素在畜禽养殖中的大量使用有关[43-45]。在中国的畜禽养殖中，抗生素大量用于治疗细菌感染[23]，为了满足畜禽养殖业对畜禽产品的高需求，抗生素常被用作饲料添加剂。这些耐药基因型和黏菌素耐药性的高共存率表明，通过持续使用相应的抗生素，有可能实现细菌对黏菌素耐药性的共同选择。其结果是在缺乏黏菌素选择压力的情况下，携带黏菌素基因的质粒持续存在并传递。所以，最先报道的IncHI2质粒pHNSHP45-2含有16种耐药基因和8种耐药表型，随后携带mcr-1基因的IncHI2质粒被陆续分离出来[41，46-48]。

消毒剂和金属抗性基因可以共同选择抗生素耐药性[49]，这增加了抗生素耐药性传播的风险。一些重金属被用作畜禽养殖的饲料添加剂，促进动物生长[50]。例如，铜、锌常被用作饲料补充剂[51-52]，这可能加剧动物源细菌的抗生素耐药性[52]。黏土是一种含有多种金属元素的新型饲料添加剂，其具有促进动物生长、减少真菌污染的作用，在食品动物育种中得到了广泛使用[53]。另外，黏土中的金属元素含量，如砷、铅、镉和氟含量，远远高于正常水平[54-55]。本研究在大部分携带mcr基因的质粒中发现了消毒剂和重金属抗性基因，这表明相关基因和黏菌素耐药基因存在共选择的风险。在控制黏菌素耐药性水平时，应将重金属耐药耦合因素考虑其中，减少饲料中重金属的添加。

2017年，黏菌素已被禁止用于饲料中，但是2020年仍陆续有关于mcr-1携带质粒的报道[19]。本研究结果表明，携带mcr的质粒具有很强的传播能力，可能与抗生素耐药基因和抗重金属基因等危险因素共同选择。因此，本研究结果将有助于更好地研究黏菌素耐药性的持续传播因素。由于mcr质粒序列的报道呈爆发性增长，下一步可以结合更多的序列数据进行mcr质粒的流行性和特征分析，挖掘更详尽的质粒特征。动物源细菌耐药性监测是研究耐药水平变化的基础，未来应持续进行黏菌素耐药性监测并关注mcr基因的阳性率变化趋势；另一方面，要筛选黏菌素耐药菌，并进行基因组完成图测序，长期研究mcr质粒的流行性和特征变化。在我国，畜禽养殖中“饲料环保化”(减少重金属添加)与“兽用抗生素减量化”(禁用、少用抗生素)是大势所趋，相信在政府的双重施策下，动物源细菌耐药性会得到更有效的控制。