青花菜细胞质雄性不育相关LncRNAs的鉴定与表达分析

裴徐梨，荆赞革,*，焦 鹏，唐 征

(1 昆明学院 农学与生命科学学院，昆明 650214；2 温州科技职业学院 农业与生物技术学院，浙江温州 325006)

青花菜(BrassicaoleraceaL.var.italica)为十字花科芸苔属甘蓝种的一个变种，在世界各地广泛栽培。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)的应用可以有效提高青花菜杂交种质量[1]。目前青花菜细胞质雄性不育发生机制仍未彻底明确。因此，进一步研究青花菜长链非编码RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)在雄性不育发生过程中的作用显得尤为重要。

研究结果表明LncRNAs可在转录、转录后和表观遗传水平上调控多种生物学过程[2-3]。 自LncRNA在人类中报道以来[4]，动植物中鉴定得到越来越多LncRNA。然而，对植物LncRNA的深入研究仅限于少数模式植物。如水稻XLOC_057324可以影响穗轴发育和植株育性[5]。玉米的zm401可调控小孢子的发育[6]。拟南芥的IPS1可通过抑制miR399的剪切来促进磷的吸收[7]。

目前，一些与细胞质雄性不育相关的基因被克隆出来并进行深入研究。然而，关于LncRNA在雄性不育过程的作用却知之甚少。本研究利用illumina测序技术鉴定了青花菜细胞质雄性不育相关LncRNAs，并对其靶基因和表达特征进行了研究。并利用qRT-PCR技术对部分差异LncRNAs的表达特征进行了检测。为进一步阐明LncRNAs参与青花菜雄性不育发生机制提供新的路径。

1 材料和方法

1.1 材 料

以饱和回交的青花菜Ogu细胞质雄性不育系及其保持系为试验材料，采集不同发育时期的花蕾以及花蕾的不同部位[8]。

1.2 方 法

1.2.1 青花菜RNA文库构建和RNA-seq数据分析总RNA提取合格后，进行文库构建，最后使用illumina HiSeq2500进行测序。利用TopHat软件将过滤得到的干净读序比对到参考基因组。使用Cufflinks和Scripture软件拼接转录本。

1.2.2 青花菜LncRNA鉴定对拼接好的转录本进行LncRNA鉴定。首先去除长度< 200 nt、reads覆盖度小于3及与已知mRNA重叠的3种转录本。然后分别利用CPC和CNCI软件预测转录本的蛋白编码潜能，去除CPC评分大于0且CNCI评分小于0的转录本。剩余含有已知蛋白结构域的转录本在Pfam数据库中进一步筛除。最后使用Cuffcompare将组装好的转录本与数据库中的rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、premiRNAs和pseudogenes(假基因)进行比对，剩余的转录本则被定义为候选LncRNAs。

1.2.3 青花菜差异表达LncRNA的筛选利用FPKM法计算LncRNA转录本的表达量。以|fold change|≥2且FDR <0.05为标准来鉴定差异表达LncRNAs。

1.2.4 青花菜LncRNAcis靶基因预测与功能注释LncRNAs可通过顺式(cis)作用方式调控邻近基因，其上下游各100 kb内的编码基因可作为cis靶基因，并对其进行功能注释。P≤0.05的GO和KEGG条目则定义为显著富集。

1.2.5 雄性不育相关LncRNAs的qRT-PCR分析qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(大连TaKaRa公司)进行。反应条件参照裴徐梨前期研究，以青花菜actin基因作为内参基因[9]。随机选择16个雄性不育相关的LncRNAs进行qRT-PCR检测，引物序列见表1。基因相对表达量通过2-ΔΔCt法进行计算。

2 结果与分析

2.1 RNA测序结果分析

不育系和保持系分别获得约10.8 G和9.8 G的干净读序，GC含量分别为45.64%和45.19%。将干净读序比对到参考基因组，不育系及其保持系分别有54.95% 和55.74% 的序列可比对上(表2)。

2.2 青花菜LncRNAs鉴定

转录本拼接共得到174 813条转录本。根据鉴定流程，排除掉长度< 200 bp、外显子数<2和最小读序覆盖<3的4 479条转录本、31 714条已知蛋白编码转录本和126 759条不在i、u和x组的转录本。最终4 326条转录本被鉴定为高置信度的LncRNA。其中，基因间隔区LncRNA为4 033条，内含子间LncRNA 为181条，反义LncRNA为112条。

2.3 青花菜不育系及其保持系差异表达LncRNAs的鉴定

对差异表达LncRNA (differentially expressed LncRNA，DE-LncRNA)进行鉴定，在不育系和保持系中共得到37个LncRNA存在差异。其中34个DE-LncRNA同时存在于2个样本中，3个DE-LncRNA(XLOC_005260、XLOC_007656和XLOC_034364)为保持系特有的。

对LncRNA的差异表达程度进行分析，发现在上调LncRNA中XLOC_005260的log2FC值(4.75)最高，XL0C_041886(log2FC = -4.50)是下调LncRNA中表达差异最显著的。聚类结果表明这些差异LncRNA在不育系和保持系中展现出不同的表达模式(图1)。

2.4 青花菜不育系及其保持系差异LncRNAs的靶基因预测

对差异LncRNA的cis靶基因进行预测，共得到370个靶基因。每个差异LncRNA靶向的靶基因数目差异较大。其中XLOC_006651的靶基因数最多，为25个，其次是XLOC_038298(24个)和XLOC_017574(19个)。同时，2个差异LncRNA只有1个靶基因。

GO分析表明，这些靶基因可注释到19个生物学过程条目、16个细胞成分条目和17个分子功能条目。GO条目富集分析发现预测靶基因参与了多种生物过程，包括细胞内、蛋白结合和细胞蛋白代谢过程。KEGG分析得到34条与差异LncRNAs相关的代谢通路，其中靶基因参与最多的通路为氨基酸生物合成、碳代谢和核糖体相关。

2.5 青花菜差异LncRNAs的表达特征分析

为了验证差异LncRNA的表达模式，随机选取16个差异LncRNA进行qRT-PCR分析(图2)。结果发现：XLOC_011575、XLOC_039677、XLOC_037356、XLOC_013157、XLOC_006651、XLOC_013121、XLOC_016660、XLOC_003494在不育系花蕾发育早期表达量较高，之后随着花蕾的发育，表达量逐渐下降；而XLOC_040653、XLOC_021769、XLOC_038964、XLOC_037468、XLOC_017574和XLOC_014153随着不育系花蕾发育呈现出先下降后上升的模式。在保持系花蕾发育不同阶段，XLOC_013157、XLOC_034182、XLOC_037468、XLOC_017574、XLOC_014153、XLOC_006651、XLOC_013121、XLOC_016660、XLOC_003494表达量逐渐下降；XLOC_040653、XLOC_011575、XLOC_039677和XLOC_037356呈现出先升后降的表达模式，而XLOC_012613、XLOC_021769、XLOC_038964则是先降后升。XLOC_038964和XLOC_012613在花蕾不同发育阶段不育系的表达量均高于保持系。

青花菜花蕾不同部位表达特性分析结果表明16个差异LncRNA在花梗、花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊中均可表达。其中，XLOC_038964、XLOC_011575、XLOC_013157在花蕾雄蕊中表达量最低，花梗、花萼和花瓣中逐渐升高，雌蕊表达量最高。XLOC_039677、XLOC_037356、XLOC_034182和XLOC_017574呈现出相似的表达模式，只是其在花瓣的表达量有所下降。所有检测的LncRNA中XLOC_037468在雌蕊中表达量最高。

3 讨 论

大量研究表明，植物LncRNA可参与多种复杂的生物学过程，如开花调控、果实发育以及逆境胁迫响应[10]。然而，青花菜LncRNAs的生物学功能尚不清楚。本研究系统鉴定和分析了青花菜雄性不育相关LncRNAs，共获得4 326个LncRNA，其中37个差异表达，研究结果将有助于深入探讨青花菜LncRNAs参与的CMS发生机制。

LncRNAs靶基因预测可有效探究LncRNA潜在功能[11]。糖代谢对青花菜雄性不育有重要意义。在小麦胼胝质合成和降解过程中，与糖苷酶代谢相关基因的活性在可育系和不育系之间存在差异[12]。在本研究中，6个差异LncRNA为与糖苷酶代谢相关的靶基因。表达分析结果表明，它们大部分在雄性不育发生过程中表达上调。这些结果表明LncRNAs可能通过糖代谢来调控青花菜的育性。此外，还发现6个差异LncRNAs参与了谷胱甘肽代谢。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是谷胱甘肽解毒系统必不可少的调节因子。过量的活性氧可触发植物细胞程序性死亡，最终导致绒毡层细胞退化和雄性不育[13]。花粉败育过程中产生的过量活性氧可改变GST基因的表达。本研究结果发现大部分靶向GST基因的LncRNA在FS花蕾中上调表达，进一步表明这几个LncRNA可能是通过谷胱甘肽代谢来参与青花菜CMS的过程。

LncRNAs是基因转录的调节因子[9]。本研究结果中多个差异LncRNA的靶基因为转录因子。NAC转录因子是XLOG_011575的靶基因，可在水稻中显著调控可育花粉比例和雄性不育[14]。本研究测序数据得出XLOG_011575在不育花蕾中表达上调，表明NAC可能在青花菜CMS发生过程中起重要作用。MYB是另外一个重要的转录因子。已有研究表明，MYB26在花药内壁二次增厚过程中对花药开裂和育性起关键作用[15]。而MYB33和MYB65是拟南芥花药正常发育的重要组成部分[16]。本试验鉴定到的靶基因中发现了3个MYB家族转录因子， 推测LncRNA通过调控MYB表达量的变化可能会导致青花菜的CMS发生。