黄腐酸对水稻幼苗根系生长的影响及其与生长素的关系

王潇潇，伍 宏，陈思衡，甘立军

(南京农业大学 生命科学学院，南京 210095)

高等植物根系的生长发育在其生长过程中起着非常重要的作用，植物根系类型可大致分为两类：拟南芥等双子叶植物所具有的直根系和水稻等单子叶植物所具有的须根系[1,2]。须根系主要由种子根、侧根与不定根组成。水稻萌发时形成一条种子根，随着幼苗的发育产生数目较多的不定根，主根和不定根都可以在中柱鞘上发育出侧根，以便更多地吸收水与养分[3-6]。

黄腐酸(fulvic acid, FA)与腐殖酸(humic acid, HA)是土壤腐殖质(humus, HS)的主要成分[7-8]。FA具有良好的水溶性，且在酸、碱条件下均可溶解[9]。早期在拟南芥和番茄上的研究表明，FA可通过调控生长素的信号转导来促进根的伸长生长和侧根发生。Schmidt等[10]向无菌培养基中添加FA后，野生型拟南芥的根毛数量和长度增加，而生长素相关的突变体则无此效应。Canellas等[11]用FA处理野生型番茄后其侧根数量增加，但FA不能促进生长素响应缺陷突变体dgt的侧根发生。通过GUS染色的方法研究拟南芥侧根起始点的IAA响应也发现，外源施加FA可以引起与IAA处理相同的转录活性，且可被IAA抑制剂如2-(对-氯苯氧)-异丁酸(p-chlorophenoxy isobutyric acid, PCIB)抑制。这些证据均表明，外源FA可能通过影响生长素信号通路来调控植物的根系生长和发育。

目前关于FA对植物生长的促进作用在水稻中的研究尚少。水稻为单子叶植物，其根系形态与拟南芥等双子叶植物有很大差别，侧根发生的过程也不尽相同。过往研究中关于FA对水稻的作用，多为研究大田环境中FA对重金属离子吸收的影响[12-16]，或笼统地研究土壤中提取的HS混合物对水稻生长的影响[17-18]。具体到FA对于水稻根系生长的作用以及相关机理研究较少。本实验研究了FA对水稻幼苗根系发育的影响，并初步探究了FA和生长素在调控水稻幼苗根系的生长和发育中的相互关系。为生产实践中应用FA调控水稻根系生长、培育优质水稻苗提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 种子和试剂

本试验参试水稻(OryzasativaL.)品种为‘宁粳6号’，种子购自苏红旗种业股份有限公司。试验所用试剂黄腐酸(FA)购自上海邦景实业有限公司，生长素合成抑制剂4-联苯硼酸(4-biphenylboronic acid, BBo)、4-苯氧基苯基硼酸(4-phenoxyphenylboronic acid, PPBo)以及生长素极性运输和信号转导抑制剂三碘苯甲酸(triodobenzoic acid, TIBA)、对氯苯氧基异丁酸(p-chlorophenoxy isobutyric acid, PCIB)均为Sigma公司产品。

1.2 种子萌发与植株培养

选取形状饱满、大小均匀且无病虫害的水稻种子，将种子浸泡于含有0.04%苯菌灵的去离子水中，30 ℃下浸种 1 d 后用去离子水洗净种子。把种子置于湿润的吸水纸上，于30 ℃的黑暗培养箱中萌发。当大多数种子萌发至种子根长约 1 cm 时，将根长一致的种子移栽到含有1/4 IRRI营养液的塑料水杯中处理。水杯四周和底部包裹避光。

1.3 FA和生长素抑制剂处理

1.3.1 FA处理使用含有不同浓度(50、100、200、400和800 mg·L-1)FA的营养液处理水稻幼苗。将FA溶解于营养液中并调节pH至5.0，营养液每 3 d 更换一次，每处理3次重复。处理 6 d 后采收植株进行数据测定。

1.3.2 IAA抑制剂处理使用少量二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)分别溶解BBo和PPBo制成母液，配置为含有3 μmol·L-1BBo和3 μmol·L-1PPBo的1/4 IRRI营养液。使用少量DMSO溶解PCIB制成母液，配置为含有30 μmol·L-1PCIB和 1 μmol·L-1TIBA的1/4 IRRI营养液。水稻幼苗在上述培养液中培养6 d。

1.3.3 FA与IAA抑制剂共同处理使用少量DMSO溶解BBo、PPBo、PCIB和TIBA，加入含400 mg·L-1FA的营养液中，分别配置为含有 3 μmol·L-1BBo、3 μmol·L-1PPBo、30 μmol·L-1PCIB和 1 μmol·L-1TIBA 的1/4 IRRI营养液。为避免不同溶剂影响实验结果，所有处理组的营养液中DMSO浓度相同。水稻幼苗在上述培养液中培养6 d。

1.4 根系形态观测

FA处理6 d 后，收获水稻幼苗，以去离子水洗净根系。选取长势相对一致的幼苗，使用刻度尺测量其种子根长、人工计数种子根上所有长度大于0.5 mm的侧根数量；以刻度尺测量侧根的长度，并计算其平均值；以种子根上所有侧根数量除以种子根长，得到幼苗的侧根密度。

1.5 根尖IAA含量测定

处理6 d 后，收获水稻幼苗，用去离子水洗净根系。迅速剪下幼苗的所有根尖(距离根尖端2 cm长)；取0.25 g根尖样品加入4 ℃预冷的甲醇2 mL，在液氮中冰冻研磨后加入甲醇，置于4 ℃浸提 18 h；10 000 r·min-1、4 ℃ 离心20 min，取上清液过预先用2 mL甲醇处理过的C-18固相萃取柱，然后用N2吹干，-80 ℃冰冻保存。采用ELISA法检测样品中的IAA含量[19]。

1.6 数据统计分析

采用SPSS软件进行单因素方差分析、双因素方差分析和多重比较，用GraphPad软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 FA浓度对水稻幼苗根长以及侧根发生的影响

在含有不同浓度的FA中水培 6 d 的水稻幼苗根系照片(图1，A)显示，FA处理促进了水稻幼苗种子根和侧根的伸长生长；100、200、400和800 mg·L-1FA处理水稻种子根长分别比对照显著增加15.72%、28.1%、34.1%和41.02%(图1，B)， 400和800 mg ·L-1FA处理的平均侧根长分别比对照显著增加了39.1%和56.0%(图1，C)。同时，水稻幼苗种子根上的所有侧根的数量(长度大于0.5 mm)随着FA浓度上升而逐渐增加，当FA浓度 ≥ 100 mg·L-1时与对照组均有显著差异，增幅分别达到25.6%、50.1%、87.4%和126.8%(图1，D)。另外，FA处理也增加了水稻幼苗根系的侧根密度，并有随FA浓度上升而增加的趋势，且在400和800 mg ·L-1FA处理下与对照差异显著，如400 mg·L-1FA 处理的侧根密度为对照的1.67倍。考虑到FA的剂量和效应，本研究选择400 mg·L-1FA进行后续实验。

2.2 FA浓度对水稻幼苗根尖游离IAA含量的影响

为了确定FA对水稻内源IAA含量的影响，选择了25、100和400 mg·L-1FA处理水稻幼苗，6 d后检测幼苗根尖的游离IAA含量。结果(图2)表明，水稻幼苗根尖游离IAA含量在25 和100 mg·L-1FA处理下与对照无显著差异，但在400 mg·L-1FA处理下比对照组显著提高1.81倍。

2.3 生长素合成抑制剂对FA诱导的根伸长生长及侧根发生的影响

BBo和PPBo可抑制拟南芥生长素合成途径中的关键酶黄素单加氧酶(YUCCA)的活性，从而抑制IAA的生物合成[20]。图3显示，在不添加FA条件下， 3 μmol·L-1BBo 处理可使幼苗的种子根长比对照(CK)显著增加13.16%(图3，A)；3 μmol/L BBo 或 PPBo使幼苗的平均侧根长比CK分别显著降低38.7%和29%(图3，B)，但对侧根数量没有显著影响(图3，C)；由于这些IAA合成抑制剂促进了种子根的长度增加，因此使其侧根密度受到显著抑制(图3，D)。

同时，在添加FA的条件下，研究IAA是否参与FA调控的水稻根的生长。结果发现，FA与BBo 或PPBo 共同处理显著降低了FA对种子根伸长生长的促进作用。其中，与FA处理相比，FA+BBo和FA+PPBo 共同处理幼苗的种子根长略有下降，它们的侧根长分别显著降低66.3%和71%(图3，B)，而其侧根数量分别显著降低80.9%和80%(图3，C)，IAA合成抑制剂与FA共同处理也显著降低了幼苗的侧根密度(图3，D)。另外，FA与对照、FA+BBo与BBo 、FA+PPBo 与PPBo处理相比，幼苗的根系生长指标均显著增加，进一步证明FA对种子根伸长生长的促进作用。

2.4 生长素极性运输和信号转导抑制剂对FA诱导的根伸长生长及侧根发生的影响

PCIB和TIBA分别是生长素的信号转导和极性运输抑制剂。PCIB和TIBA 处理的水稻幼苗平均种子根长均比对照组显著下降，分别为对照的42.0%和27.4%(图4，A)；PCIB 处理的平均侧根长也受到极显著的抑制，仅为对照组的37.1%，而TIBA 处理幼苗的平均侧根长与对照组无显著差异(图4，B)；与对照相比，PCIB 和 TIBA处理均对水稻幼苗的侧根数量有极其显著的抑制效果(图4， C)，并显著降低水稻幼苗的侧根密度(图4，D)。

同时， PCIB和TIBA与FA共同处理组的水稻种子根长均比FA处理组显著降低，分别为FA处理的48.3%和82.0%(图4，A)；与FA处理相比，FA+PCIB 处理幼苗的平均侧根长显著降低了75.3%，但FA+TIBA处理对侧根长度没有显著的影响(图4，B)； FA+PCIB 和FA+TIBA处理的幼苗侧根数量均比FA处理显著降低，分别为FA处理的7.2%和57.3%(图4，C)；FA+PCIB处理幼苗的侧根密度也比FA处理显著降低，仅为FA处理的19.1%，而FA+TIBA 处理侧根密度与FA处理没有显著差异(图4，D)。另外，与不添加FA各处理(control、PCIB、TIBA)相比，相应添加FA处理幼苗的种子根长、平均侧根长、侧根数量和侧根密度均不同程度增加，且FA和TIBA+FA处理的增幅均达到显著水平。

3 讨 论

近几十年来腐殖酸的相关研究表明， 包括FA在内的多种腐殖酸对植物的生长发育有多种促进作用，因此腐殖酸被广泛应用于农业领域。农业上FA主要应用于叶面肥或于复合肥中，通过添加适量FA提升肥料利用率，以及将FA作为土壤改良剂用以改良长期使用化肥而板结的土壤。

本研究在水培条件下使用50～800 mg·L-1FA处理水稻幼苗，发现FA达到一定浓度(≥ 100 mg·L-1)后显著促进幼苗根系伸长生长和侧根发生。HA与FA均是HS的有效组分之一，在Zandonadi等[13]的研究中，使用从土壤中提取的HA处理可以显著促进玉米幼苗的侧根发生；Mora 等[21]的研究表明HA处理的黄瓜根长和根系密度显著增加。在本研究中FA对水稻幼苗侧根发生的促进作用与上述的研究结果一致，FA有与HA类似的促进植物根系伸长生长和侧根发生的效果。

生长素类植物激素在植物根系的生长发育过程中起着非常重要的作用，其极性运输和信号转导途径被认为与根系生长尤其是侧根发生关系极为密切。生长素的极性运输可以改变植物局部组织的生长素浓度[22]。植物根系中生长素的极性运输存在环流，即生长素沿着中柱往根尖运输，至根冠后再通过表皮和皮层细胞回流向上运输[23-24]。生长素的极性运输主要通过AUX与PIN蛋白家族调控完成[24-27]，一些PIN蛋白突变体的侧根密度会产生一定变化，如atpin3突变体的侧根密度明显减少[24]，而atpin2的侧根密度增多[28]。在生长素信号转导途径对侧根发生的调控研究中，目前有一种假说认为侧根发生的调控有两个关键点，一是处在合适位置的中柱鞘细胞才能形成侧根原基，一是基部分生组织存在的节律性生长素信号会影响中柱鞘细胞的激活，当原生木质部细胞的生长素浓度最大时，紧邻的中柱鞘细胞就可以开始分裂并逐步形成侧根原基[29-30]。此外，中柱鞘细胞局部的生长素信号可决定侧根的发生与发育，当生长素在中柱鞘细胞中累积到一定程度后，就可以促进中柱鞘细胞分裂形成侧根原基。如果阻断生长素信号，如使用生长素信号转导抑制剂，就可抑制侧根发生[31]；如果施加外源生长素，可使整个紧邻木质部的中柱鞘细胞都被激活，则可以发育成侧根[32]。目前的假说还有待完善，但在一定程度上解释了侧根发生与生长素信号之间的联系。

生长素的各类抑制剂对植物的根系发育也有一定影响。Kakei 等[20]的研究表明，在含有1 μmol·L-1IAA合成抑制剂BBo 或PPBo的培养基上生长的拟南芥内源IAA含量显著下降，拟南芥根的伸长生长受到显著抑制。3 μmol·L-1BBo 或PPBo 处理下拟南芥的正常生长受到严重抑制，拟南芥植株表现出明显的向重力性缺失，且初生根几乎不生长。因此，本研究中选用了3 μmol·L-1作为BBo 和PPBo的工作浓度。本研究在水稻上的试验结果与拟南芥的相关结果相吻合，3 μmol·L-1BBo 或PPBo 处理显著抑制了水稻根系的伸长生长与侧根发生。Yin等[33]在水培条件下使用PCIB处理水稻，0.5～50 μmol·L-1PCIB可显著增加水稻根长，PCIB浓度超过50 μmol·L-1后显著抑制水稻根长。对此作者推测低浓度的PCIB使得水稻根系的IAA信号处于一个更适合根系伸长生长的强度，高浓度下则显示出对根系生长的抑制作用。本研究发现30 μmol·L-1PCIB处理对水稻幼苗的根系伸长生长以及侧根发生均有显著的抑制作用。综合来看，BBo、PPBo对水稻幼苗种子根长的影响和PCIB对种子根长的影响有着相似的趋势：即这些抑制剂在达到一定浓度后使根系中IAA信号水平显著下降，从而抑制根系的生长发育过程。

目前已在拟南芥和番茄等植物中对腐殖质促进植物根系生长的效应做了一些研究。HS可以促进野生型番茄的侧根发生，但番茄生长素不敏感突变体dgt侧根发生被抑制且无法被HS恢复[11]。Trevisan等[34]的研究表明，如果使用TIBA或PCIB与HA共同处理AUX1-DR5∷GUS转基因拟南芥，拟南芥中AUX1表达与只接受外源HA处理组相比受到显著抑制，幼苗的侧根密度也显著下降。HA对拟南芥和番茄幼苗侧根发生的促进作用与根系内源IAA含量以及IAA的信号转导通路有关。

在本研究中，IAA合成抑制剂可抑制FA对水稻幼苗种子根伸长生长以及侧根发生的促进作用。此外，对水稻根尖内源IAA含量的测定显示400 mg·L-1FA显著增加水稻根尖内源IAA含量，可推测在水稻中FA可能通过增加内源IAA含量的方式达到促进根系伸长生长与侧根发生的效果。FA可促进水稻根系内源IAA含量上升，推测可因此促使更多的中柱鞘细胞分裂并形成侧根原基，增加侧根原基的数量，从而提高侧根密度。此处需进一步的研究确认其中的具体机制。

IAA信号转导抑制剂可显著抑制FA对幼苗根系伸长生长与侧根发生的促进作用。FA对水稻幼苗侧根发生的促进作用与HA对拟南芥侧根发生的促进作用一致[35]，促进作用可以被PCIB抑制的结果也与Mora等关于HA的研究结果一致[21]。本研究中TIBA可显著抑制FA对水稻幼苗种子根伸长以及侧根发生的促进作用，但无法抑制FA对水稻幼苗侧根伸长生长的促进作用，表明FA对水稻幼苗根系伸长生长的效应可能存在不受IAA极性运输以及信号转导影响的途径，而FA对水稻幼苗侧根发生的促进作用受到IAA极性运输以及信号转导途径影响。植物体中PCIB可通过干扰泛素-蛋白酶体途径抑制Aux/IAA蛋白降解，从而抑制受IAA调控的基因转录和表达，显示出根系生长受阻、侧根发生受抑制和向重力性下降的表型[36]。FA对根系伸长生长与侧根发生的促进作用被PCIB抑制，当PCIB阻碍了水稻体内的IAA信号识别过程时，FA对水稻幼苗根系生长的促进作用便受到抑制。这表明FA对水稻幼苗根系生长的促进作用需通过IAA信号转导通路实现。