白菜型冬油菜HDACs基因家族的鉴定及表达分析

徐 芳，刘丽君，李 鹏，姚彦林，孙万仓，武军艳*

(1 甘肃农业大学 农学院，兰州 730070；2 干旱生境作物学国家重点实验室，兰州 730070)

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在基因表达调控方面扮演着重要角色，涉及染色质蛋白与转录因子间的相互作用，并且这种调控是在不改变DNA序列的条件下影响基因的转录表达[1]。乙酰化是动态的，可逆的过程，包括组蛋白乙酰化和去乙酰化，分别由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化[2]。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)广泛存在于动物、酵母和植物体内。HDACs在植物当中可以分为3类，分别是RPD3/HDA1、SIR2、HD2[3]。RPD3/HDA1中所有的成员都包含了一个典型的组蛋白脱乙酰酶域，其酶的活性的发挥需要Zn2+的存在[2]；HD2这类亚家族对植物来说是一类特有的重要蛋白[4-5]；SIR2家族与RPD3/HDA1和HD2亚家族结构不相似，只有在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的存在下，其酶活性才能被发挥[6]。随着HDACs基因的研究增多，发现组蛋白去乙酰化参与植物根[7]及花的发育[8]等，表明其对植物的发育有着重要的作用，此外，组蛋白去乙酰化还在植物响应盐胁迫[9]和低温胁迫[10]等逆境胁迫方面发挥重要作用。

先前，有关HDACs在植物中的研究主要集中在模式植物拟南芥中。最近几年在水稻[11]、甜橙[12]和番茄[13]中也有相关研究的报道。拟南芥AtHDA19除与环境胁迫有关[14]外，还与生殖发育有关[15]。在玉米中，ZmHDA101调控玉米籽粒大小[16]。李涛等[17]研究辣椒发育过程中，发现CaHDA1的表达水平在果皮和胎盘成熟过程中逐渐升高，这意味着该基因可能参与了辣椒果实后期的发育。在龙眼中，DlHDT1可能参与其体胚形态的建成和响应干旱等逆境胁迫应答[18]。在低温胁迫下，抑制了毛白杨HDA901、HDA910和SRT901三个基因在茎或根中的表达[19]。林莹等[20]发现森林草莓在低温胁迫8 h后，FvHDA1表达水平显著升高，而其他基因没有发生显著变化，表明FvHDA1在森林草莓低温胁迫响应过程中可能发挥了一定调控作用。

温度和干旱等逆境胁迫会对植物的生长发育造成严重危害，导致其产量和质量的下降，这使得人们对植物非生物胁迫响应机制有了更多的关注[21]。中国北方地区冬季寒冷且干燥，白菜型冬油菜是重要的油料作物之一，具有非常明显的经济效益[22-23]，白菜型冬油菜不仅可以安全的越冬，而且还有很好的适应性[24]。所以对白菜型冬油菜生长发育及逆境胁迫的耐受性进行研究对其发展具有重要意义。目前，植物HDACs逐渐受到重视，HDACs基因已从玉米、拟南芥、水稻等多种植物中得以鉴定和分析。但HDACs在白菜型冬油菜中还尚未见研究及报道，而HDACs抑制剂TSA可以被用来研究组蛋白去乙酰化酶对植物产生的影响[25]。因此，本研究通过分析TSA对白菜型冬油菜萌发特性和生理生化特性的影响，利用生物信息学方法对HDACs基因家族成员进行了鉴定及表达模式分析，阐述了组蛋白去乙酰化酶在植物生长发育和抗寒性方面发挥的作用，为进一步分析白菜型冬油菜HDACs基因家族成员功能提供一定参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验材料为甘肃农业大学提供的3个白菜型冬油菜强抗寒品种‘陇油7号’、耐寒品种‘天油4号’和弱抗寒品种Lenox。

1.2 试验方法

1.2.1 发芽试验挑选颗粒饱满一致的白菜型冬油菜种子，用75%的乙醇表面消毒30 s，1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒5 min，经蒸馏水清洗5次后，分别进行5种处理[TSA用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂]：1/2MS培养基(CK)，1/2MS+1 μmol/L TSA(T1)，1/2MS+与T1等量的DMSO(CK1)，1/2MS+3 μmol/L TSA(T2)，1/2MS+与T2等量的DMSO(CK2)。每个品种3个重复，分别在4 ℃低温培养箱和24 ℃人工气候培养箱进行萌发。

同样挑选颗粒饱满一致的白菜型冬油菜种子，置于培养皿中待露白后，移栽于花盆，幼苗长至五叶期，进行相应处理。试验设置9个处理：4 ℃、0 ℃、-4 ℃、4 ℃+50 μmol/L TSA、4 ℃+100 μmol/L TSA、0 ℃+50 μmol/L TSA、0 ℃+100 μmol/L TSA、-4 ℃+50 μmol/L TSA和-4 ℃+100 μmol/L TSA，每个处理3个生物学重复，分别处理12和24 h，采集油菜叶片，用于生理指标测定。

1.2.2 测定指标与方法种子发芽期间，常温处理第3天开始测定种子数，计算发芽势(GE)；第7天开始测定种子发芽数，计算发芽率(GP)，测定胚根长和下胚轴。低温处理置于4 ℃恒温培养箱中，种子发芽期间第8天测定发芽势，第12天测定发芽率[26]。

发芽势(GE)=初次计数发芽数/发芽试验样品粒数×100%

发芽率(GP)=末次计数发芽数/发芽试验样品粒数×100%

采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，用磺基水杨酸测定脯氨酸含量，用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性，用H2O2法测定过氧化氢酶(CAT)活性，每个指标重复测定3次[27]。

1.2.3 白菜型冬油菜HDACs基因家族生物信息学分析据李晓斐等[28]在龙眼HDAC家族成员全基因组鉴定及表达分析中的报道，利用已知Pfam号(RPD3/HDA1：PF00850、SIR2：PF02146)，在Pfam网站上下载其关键结构域序列。从油菜课题组测序的白菜型冬油菜‘陇油7号’全基因组数据库中筛选RPD3/HDA1、SIR2两个亚家族基因成员，在TAIR网站上下载拟南芥HD2家族基因的蛋白质序列作为对照，在白菜型油菜全基因组数据库中进行同源比对，用BLAST比对检索，进一步筛选出白菜型冬油菜HD2亚家族成员。之后用在线软件HMMER、SMART、CDD对所有候选基因序列进行结构域鉴定，最终筛选出具有完整保守结构域的基因序列，作为HD2家族成员。

利用MEGA7.0软件对白菜型冬油菜、拟南芥、大白菜3个物种采用Clustal W进行多序列比对，使用NJ法构建系统进化树，在线工具Evolview(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)进行绘图与美化。通过在线软件MEME(http://meme-suite.org/)分析白菜型冬油菜的保守motif；利用gff文件在GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)上对白菜型冬油菜HDACs家族成员进行基因结构的预测；用已经获得的motif、内含子、外显子文件在TBtools本地软件上进行绘图。利用在线软件PlantCARE分析HDACs家族成员的顺式作用元件。根据白菜型油菜基因组数据库提取HDACs基因家族在染色体上的位置，用Mapchart软件绘制染色体位置图。

1.2.4 白菜型冬油菜HDACs基因家族表达分析对3个试验材料分别从茎、茎生叶、花、角果、新基叶、老基叶和生长锥取材；将生长至五叶期且生长一致的幼苗在4 ℃、0 ℃和-4 ℃进行低温胁迫，分别处理0、1、4、6、12和24 h，将叶和根采样后液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱待用。

用RNA Easy Fast Plant Tissue Kit RNA Easy Fast(TIANGEN)试剂盒提取白菜型冬油菜所有样品的总RNA，PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)试剂盒反转录为cDNA；将合成的cDNA稀释10倍作为模板用于HDACs家族基因的实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR试剂盒为TIANGEN的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)。设置PCR程序为：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；以Actin作为内参基因，数据处理采用2-ΔΔCt方法。试验中所用引物序列(表1)，每个样品3次重复。利用白菜型冬油菜不同组织部位和低温处理所得到的表达量，用Origin和TBtools绘制柱状图和热图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度TSA对白菜型冬油菜种子萌发和生长的影响

24 ℃下(表2)，与CK和CK1对比，T1处理后各品种的发芽势略有降低，发芽率变化不同，其中‘陇油7号’和‘天油4号’发芽率降低，Lenox没有变化；T2处理与CK和CK2相比，发现3个品种的胚根长都显著减小(P≤0.05)。说明TSA浓度为3 μmol/L时(即T2)，对3个品种胚根的生长发育影响最大。

4 ℃下(表3)，在3个品种中，T1以CK1和T2以CK2为对照，T1和T2处理下发芽势和发芽率有所升高，表明TSA处理可能缓解了低温对其种子萌发的影响。与CK和T1相比，T2处理下3个品种的胚根长显著减小(P≤0.05)。说明TSA浓度为T2时，同样对3个品种胚根的生长影响最大。

由图1和图2可以看出，经TSA处理后，24 ℃下的根长较4 ℃下的根长明显变短，表明TSA可能在抑制根长的过程中也缓解了低温对其生长的影响。

2.2 外源TSA对白菜型油菜抗氧化酶活性及渗透调节物质的影响

2.2.1 对抗氧化酶活性的影响由图3可以看出，与CK相比，各品种内SOD、POD和CAT活性均呈现上升趋势。在4 ℃下3个品种的POD活性变化趋势相似，在外源喷施100 μmol/L TSA时显著上升(P≤0.05)，且Lenox上升幅度较大；‘天油4号’中SOD和CAT活性相对高于‘陇油7号’和Lenox，而Lenox在外源喷施100 μmol/L TSA后SOD和CAT活性有所降低。

在0 ℃下，‘陇油7号’和‘天油4号’在低温处理下和外源喷施TSA后3种酶的活性变化不大，Lenox在外源喷施TSA后3种酶活性呈现先升高后降低的趋势。‘陇油7号’和‘天油4号’SOD活性大于Lenox，而Lenox经TSA处理后POD和CAT活性变化较大。

在-4 ℃下，‘天油4号’SOD活性显著高于其他2个品种；‘陇油7号’在喷施100 μmol/L TSA处理24 h后，POD活性最大；而‘天油4号’和Lenox随着外源喷施浓度的增大和处理时间的延长POD活性先升高后降低。3个品种的CAT活性随着喷施浓度的增大和处理时间的延长有所下降，‘天油4号’和‘陇油7号’CAT活性高于Lenox。

表3 TSA处理对不同品种种子萌发特性的影响(4 ℃)

2.2.2 对渗透调节物质的影响由图4可以看出，与CK相比，各品种内可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈现上升趋势。在4 ℃处理下，‘陇油7号’和‘天油4号’可溶性蛋白含量逐渐增大，在外源喷施50 μmol/L TSA后达到最大；而Lenox在未喷施TSA处理24 h后可溶性蛋白含量达到最大，之后随TSA处理有所降低；‘陇油7号’和Lenox脯氨酸含量也是在外源喷施50 μmol/L TSA后达到最大，而‘天油4号’在4 ℃处理12 h达到最大。

0 ℃处理下，‘陇油7号’和‘天油4号’可溶性蛋白和脯氨酸含量在100 μmol/L TSA处理后达到最大，Lenox在50 μmol/L TSA处理后达到最大，在100 μmol/L TSA处理后有所下降。

在-4 ℃处理下，‘陇油7号’和Lenox可溶性蛋白含量随着外源喷施浓度的增大和处理时间的延长呈现出先增加然后减小的趋势，而‘天油4号’则是逐渐增大。3个品种的脯氨酸含量都是随着外源喷施浓度的增大和处理时间的延长之间增大的，Lenox中脯氨酸含量上升得更明显。

2.3 白菜型冬油菜BrapaHDACs家族鉴定

通过在‘陇油7号’的基因组数据库中比对，共筛选出了21个具有完整保守结构域的HDACs家族成员。与拟南芥AtHDAC的家族成员进行同源比对，根据其对比后的同源基因名称来命名，并用在线网站预测其理化性质。

HDACs各亚家族成员序列长度差异较大(表4)，氨基酸数在210～1 141 aa，分子量为23.32～129.15 kD。其中RPD3/HDA1亚家族的15个成员，蛋白等电点在4.50～6.28，均呈酸性，10个属于稳定亲水性蛋白，5个属于不稳定亲水性蛋白；HD2亚家族的4个成员，等电点均在4.6左右，呈酸性；SIR2亚家族成员的理化性质略有不同，等电点分别为6.66、8.93，一个偏中性，一个是碱性蛋白质，HD2、SIR2成员均属于不稳定亲水性蛋白。亚细胞定位后，大部分基因定位在细胞质和细胞核，少数基因成员定位在叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和质膜。

2.4 BrapaHDACs家族进化树的构建及分析

根据系统进化树(图5)可将HDACs家族分为3个亚家族，即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亚家族，RPD3/HDA1亚家族有15个成员：BrapaH-DA2/5-1/5-2/5-3/6-1/6-2/7-1/7-2/8/9/14/15/15-1/15-2/19；SIR2亚家族有2个成员：BrapaSRT1/2；HD2亚家族有4个成员：BrapaHDT1/2-1/2-2/3。且发现白菜型冬油菜HDACs家族与大白菜、拟南芥家族聚类情况相同，表明HDACs家族成员和这些物种的同源性很高，可能具有相似的生物学功能。

表4 白菜型冬油菜BrapaHDACs基因家族基本理化性质

2.5 BrapaHDACs基因家族motif、基因结构及启动子顺式作用元件分析

对白菜型冬油菜HDACs基因家族的motif和基因结构分析(图6)，在RPD3/HDA1亚家族成员中，除了BrapaHDA6-1/2这2个基因外，其余基因均含有motif6，其次除BrapaHDA15-2/14基因外，其余基因均含有motif7，BrapaHDA15-2/6-1/2的motif数最少；SIR2亚家族成员只有2个motif，且有其他基因均没有的motif18和motif19，HD2亚家族的4个基因，均含有其他基因所没有的motif11和motif13。

该家族成员所含外显子和内含子差异较大，BrapaHDA8外显子和内含子数最少，BrapaHDT1/3/2-1这3个基因内含子和外显子数目均在6、7左右，BrapaHDT2-2基因外显子和内含子数目为18、17个，与其他3个基因相差较大。这表明该家族基因在进化的过程中可能产生了一定的分化。

对HDACs家族成员启动子的顺式作用元件区域进行分析(图7)，该家族包含了MYB结合位点参与干旱诱导元件MBS、参与低温反应的顺式作用元件LTR、参与光反应的顺式调节元件G-Box、启动子和增强子区域中常见的顺式作用元件CAAT-box、赤霉素反应元件GARE-motif、转录-30左右的核心启动子元素TATA-box、水杨酸反应元件TCA-element和生长素反应元件TGA-element等相关启动子顺式作用元件。推测该基因家族可能参与植物的生长发育及逆境胁迫。

2.6 BrapaHDACs基因家族的染色体定位

染色体定位后，发现21个HDACs基因不均等分布在白菜型冬油菜8条染色体上(图8)，其中RPD3/HDA1亚家族的15个成员分布在1、2、3、5、6和9号染色体上，SIR2亚家族的2个成员分布在2和3号染色体上，HD2的4个成员分布在2、4和10号染色体上。染色体6上含有的HDACs基因最多，为5个；其次是染色体1、2、3和9，均含有3个基因，染色体10含有2个，染色体4、5分别含有1个，染色体7和8不含有HDACs基因。结果表明可能HDACs基因成员在染色体上位置的不同，也使得发挥的功能不同。

2.7 白菜型冬油菜BrapaHDACs家族基因不同组织部位表达分析

qRT-PCR结果表明(图9)，这8个基因在3个品种的不同组织中均有表达，其中BrapaHDA5-3、BrapaHDA6-1、BrapaHDA7-2、BrapaHDA8、BrapaHDA15-2和BrapaHDA19在各品种内生长锥中表达量最高。不同品种间基因表达也有明显差异，BrapaHDA5-1在‘陇油7号’的角果中表达量高，BrapaHDA19在其花中表达较高；BrapaHDA6-1和BrapaHDA8在‘天油4号’花中表达量较高；BrapaHDA7-2和BrapaHDA5-1在Lenox花中高表达；BrapaHDA5-2基因在‘天油4号’的各个组织中表达量都较高，在Lenox的角果中也出现高表达。也表明这些基因在不同品种的组织部位的生长发育方面发挥着一定功能。

2.8 不同温度胁迫下白菜型冬油菜BrapaHDACs家族基因的表达分析

2.8.1 4 ℃低温胁迫下BrapaHDACs家族基因的表达分析在4 ℃冷胁迫不同时间后(图10)，发现强抗寒材料‘陇油7号’中BrapaHDT1基因在处理12 h的叶中表达量较高，BrapaHDA5-1/5-2/5-3和BrapaHDT2-1/2-2基因在处理12 h的根中表达量较高；耐寒性材料‘天油4号’叶中，在处理1 h后，BrapaHDA5-1/8/15-2和SRT2基因出现上调表达，6 h后BrapaHDA7-1/7-2/8以及24 h后BrapaHDA6-1/9和SRT1基因表达量较高，在根中，处理1 h后大部分基因都有上调表达，12 h后HDT3和24 h后BrapaHDA8/9基因出现上调表达；在弱抗寒材料Lenox中除BrapaHDT1外，HD2亚家族其他3个基因在处理1 h的叶中表达量较高，24 h后RPD3/HDA1亚家族大部分基因有较高表达，在根中，RPD3/HDA1亚家族的个别基因在每个时间段都出现上调表达。表明这些基因可能在白菜型冬油菜响应低温胁迫方面起到一定作用。

2.8.2 0 ℃低温胁迫下BrapaHDACs家族基因的表达分析在0 ℃冷胁迫不同时间后(图11)，发现在强抗寒材料‘陇油7号’中RPD3/HDA1、SIR2和HD2三个亚家族的部分家族成员在处理24 h后的叶中出现上调表达，在根中几乎每个时间段都有不同基因上调表达；在耐寒性材料‘天油4号’叶中，处理1 h后BrapaSRT2和BrapaHDT1基因表达较高，处理24 h后大部分基因有较高表达量，在根中，处理4、6和24 h后有个别基因表达较高；弱抗寒材料Lenox的叶在处理1 h后，表达量较高的基因主要为RPD3/HDA1亚家族成员，HDACs家族成员在其他时间段表达量变化不明显。

2.8.3 -4 ℃低温胁迫下BrapaHDACs家族基因的表达分析在-4 ℃冷胁迫不同时间后(图12)，发现在强抗寒材料‘陇油7号’中BrapaHDA7-2基因在处理4 h后和BrapaHDA15-1在处理6 h的叶中表达量上调，BrapaHDA7-2、BrapaHDA5-1、SRT1和BrapaHDT2-2基因在处理24 h后的根中表达量较高；在耐寒性材料‘天油4号’中BrapaSRT2

基因在处理1 h后的叶中表达量较高，在处理12和24 h后HDACs绝大部分基因上调表达，处理12 h后大部分基因在根中的表达量较高，处理24 h后BrapaHDA2基因出现高表达；在弱抗寒材料Lenox中BrapaHDA2、BrapaHDA9和BrapaHDA19基因在处理4 h的叶中上调表达，BrapaHDA6-1在处理1 h和BrapaHDA6-2、SRT2处理4 h后的根中表达量较高。

3 讨 论

3.1 TSA对白菜型冬油菜生长发育特性和抗寒性指标的影响

有研究表明在TSA处理下，组蛋白H3和H4乙酰化水平会被显著提高[29]，本研究发现3个品种经TSA处理后，其根长均受到抑制，这与胡欢等[30]TSA处理对拟南芥主根的生长有抑制作用相一致。拟南芥种子被TSA处理后发现，加快了种子的萌发[31]，本实验发现在低温下经TSA处理的种子萌发率有所升高，常温下对根的抑制作用要强于低温处理下的，表明TSA可能促进了组蛋白乙酰化功能的发挥，在一定程度上缓解了低温对种子萌发及生长的影响。植物在感受低温和其他胁迫后在体内合成大量的保护性物质，来调节生理生化变化使细胞渗透势保持平衡来维持细胞膜的稳定性[32-33]。研究表明SOD、POD、CAT活性的升高和可溶性蛋白、游离脯氨酸的含量的积累与抗寒性呈显著的正相关的关系[34]。本研究结果显示，抗氧化酶活性和渗透调节物质的含量在3种不同抗寒性油菜中出现不同程度的上升，TSA处理后有不同程度的升高和下降，Lenox中比较明显，这可能与其材料的抗寒性有关，也表明TSA可能会激发抗寒基因的表达，从而增强抵御抗寒能力，维持正常的生长发育。

3.2 白菜型冬油菜HDACs基因家族特征分析

在番茄[35]、葡萄[36]和荔枝[37]等多种植物中，已经对HDACs进行了全基因组鉴定。本研究在白菜型冬油菜中共鉴定出21个HDACs基因，通过进化树构建发现白菜型冬油菜HDACs基因家族归类情况与龙眼[28]和毛果杨[38]中一致，分为3个亚家族。保守结构显示RPD3/HDA1亚家族内motif数差异较大，表明该亚家族可能在进化过程中产生了一定分化，而SIR2和HD2亚家族内motif数是一致的，表明其亚家族成员更加保守且稳定。亚细胞定位表明，HDACs家族成员主要分布在细胞质和细胞核，HD2亚家族4个成员中有2个基因分别位于叶绿体和过氧化物酶体，这与拟南芥和玉米中的HD2全部定位于细胞核有所不同[2]，可能这2个基因在白菜型冬油菜中发挥着区别于其他物种的功能，但还有待研究。

3.3 白菜型冬油菜HDACs基因家族成员在生长发育和低温胁迫方面的响应

HDACs在植物生长发育方面发挥着重要作用，已有研究表明，拟南芥中AtHDA6在植物叶片发育和开花等方面发挥着重要作用[39]，香蕉中MaHDA6[40]参与其果实发育及成熟相关过程，HDA19[41]也参与调控开花，而本实验中BrapaHDA6-1和BrapaHDA19与其同源基因HDA6和HDA19有所不同，除参与不同白菜型冬油菜开花还参与生长锥的生长发育。其次BrapaHDA5-1、BrapaHDA7-2和BrapaHDA8在不同品种的不同部位有差异表达，表明不同基因在不同的抗寒性材料的生长发育方面发挥着不同作用。

在逆境胁迫下，植物体内响应逆境胁迫的相关蛋白被激活，抗逆功能基因表达，因而提高植物的抗逆性[42]。先前研究显示，HDA6在低温胁迫中有所响应[6]，本研究中BrapaHDA6-1和BrapaHDA6-2基因在3个品种中都有出现上调表达，表明该基因可能是参与其响应低温的关键基因。玉米RPD3/HDA1家族成员，在受到低温胁迫时，表达量会上升[43]，而本实验中RPD3/HDA1家族部分成员在受到低温胁迫时，在不同品种中也出现了差异表达，但有所不同的是HD2亚家族成员在受到低温胁迫时，也表现出了不同程度的响应。这些结果表明HDACs在白菜型冬油菜响应低温胁迫方面起到一定作用。但这些基因具体是如何调控冬油菜生长发育和响应低温的，还需要后续进行其功能的验证和调控机制的挖掘。

本研究利用TSA处理不同抗寒性白菜型冬油菜，发现其根长受到抑制；低温下喷施不同浓度TSA发现抗氧化酶的活性和渗透调节物质的含量都有所升高，在白菜型冬油菜基因组中初步鉴定出21个HDACs基因，不同组织部位和低温胁迫表达情况结果表明，HDACs的3个亚家族部分成员在强抗寒材料‘陇油7号’、耐寒性材料‘天油4号’和弱抗寒材料Lenox的生长发育及抗寒性方面起着关键作用。也为后续冬油菜HDACs基因家族功能验证及挖掘抗寒性关键基因的研究奠定一定基础。