3种粒型油莎豆种质特性分析

李春鑫，王会伟，王 艳，刘玉兰，陈道玉，杨铁钢*

(1 河南省农业科学院 经济作物研究所，郑州 450002； 2 河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001；3 息县农业科学研究所，河南信阳 464300)

世界人口的不断增长和社会生活水平的提高，使人类社会对食用植物油的消费需求日益增长，同时，世界范围内对低价生物柴油的需求也十分旺盛，这都要求油料作物必须保持产量水平的持续提高[1]。因此，亟需寻找一种可以快速提高油料产能的新途径。油莎豆(CyperusesculentusL. var.satovus)，通用名‘虎坚果’(tigernut)，又名‘虎坚果莎草’(tigernut sedge)、‘铁荸莽’、‘地下核桃’等，是目前已知植物中唯一在地下块茎中大量积累油份的作物[1]。其产量高、易种易管、抗旱耐涝、边际土壤适应性强，营养价值丰富[1]，既可食用也可用作生物燃料，是较为理想的作物类型[2]。油莎豆在植物学上属于单子叶纲莎草科莎草属多年生草本植物[1]，广泛分布于热带、温带和寒带，属于C4型植物[3]，在农业上被用作一年生作物，在中国黄淮地区生育期约130～150 d。

油莎豆通过地下匍匐茎(后面统称为茎豆)膨大收获经济产量，其茎豆含20%～40%淀粉、20%～36%油、15%～20%糖、5%～9%蛋白质和6%～10%纤维[1, 4]，在非洲部分国家一直被作为重要营养食物来源之一[1]。研究显示油莎豆茎豆中含有高水平的磷、铁和钾，以及维生素E和C[5]。油莎豆茎豆有生吃、榨油、面粉全食和制作成豆奶等多种食用方式，其中，以油莎豆为主原料的饮料在西班牙和西欧广受欢迎[6]。油莎豆茎豆中含有大量的糖分，可用作冰淇淋、饼干、沙拉、汤、酸奶、糖果、婴儿食品、保健棒、面包、蛋糕和其他食品的调味剂[7]。有研究表明，油莎豆茎豆具有疏肝、通气、健脾和健胃功效，在促进血液循环，减少心血管疾病和心脏病发作，防止中风和呼吸道炎症，治疗肠胃胀气和降低患结肠癌风险等方面也有较高的药用潜力[1,6]。

莎草科物种普遍存在后减数分裂行为及染色体的分裂和融合[8]。油莎豆染色体数目的研究结果也存在争议。有报道认为它的基本染色体数目(n)是54或108[8]，但有学者先后得出油莎豆种内染色体数目为18、108和206等不同结论[8-9]。中国的油莎豆经过多次国外引种和国内各省份间交换，目前保存的种质来源复杂，背景不明，其染色体数目和倍性研究基本处于空白状态，严重阻碍了油莎豆品种的遗传改良和基础研究工作的深入开展。

茎豆是油莎豆核心经济价值部位，从茎豆形态上，可以分为中长、中圆及大粒型3类。本研究选用‘豫油莎2号’(中圆粒)、‘豫油莎3号’(中长粒)和‘YYS-4’(大粒)3种粒型油莎豆材料，通过分析株高、分蘖、粒重、单株结豆数、光合特性等形态性状和品质性状，明确了中国油莎豆种质的形态学和品质性状特点。利用染色体制片、荧光染色和端粒探针荧光原位杂交技术，首次对中国3种粒型油莎豆材料的染色体数目进行了解析，其结果对于促进中国油莎豆细胞学的发展，加快中国油莎豆资源的应用和基础研究具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 供试材料

3种不同粒型油莎豆材料‘豫油莎3号’(图1，A)、‘豫油莎2号’(图1，B)、‘YYS-4’(图1，C)均由河南省农业科学院经济作物研究所油莎豆育种研究室选育和提供。供试材料各选取5粒茎豆，以单粒播的方式种植于沙壤土中，在植株长至成熟后，测定每个材料的形态学相关性状，测定性状有：株高(自地面量至最高叶片顶端)、分蘖数(分蘖高度大于25 cm)、叶长(主分蘖最长叶片自叶环至叶尖1/3处宽度)、叶宽(主分蘖最长叶片自叶环至叶尖1/3处宽度)、单粒重(单株茎豆总重/单株总粒数)、粒色、粒长(挑选10粒饱满的茎豆，总长度/10)、粒宽(挑选10粒饱满的茎豆，总宽度/10)及结实集中度(重量大于等于平均单粒豆重的粒数/总粒数)。性状测定结果去掉最高和最低值，剩余3个值取平均数作为该性状测定值。

1.2 供试材料品质性状测定

取3个供试材料的茎豆200 g左右，送至农业农村部农产品质量监督检验测试郑州分中心进行品质性状测定，蛋白质、总灰分、含油量、淀粉、可溶性糖测定分别依据标准GB5009.5-2016、GB5009.4-2016、NY/T1285-2007、GB5009.9-2016和GB/T37493-2019进行检测。

1.3 光合性状测定

在晴天条件下选取3个供试材料，每个材料选取5株长势、叶片着生部位、叶面积大小和朝向基本一致的主茎叶片，测定叶绿素荧光参数和光合参数，剔除最高和最低值，剩余3株数据取平均值作为测定结果。测定时尽量测定叶片中部并避开叶片的主脉。叶绿素荧光参数测定使用FMS-2脉冲调制式荧光仪(Hansatech, UK)，光合作用测定使用CIRAS-3便携式光合荧光测定仪(美国PP Systems公司)，以上两种设备测定时严格按照仪器使用说明书进行操作。

1.4 染色体数目分析

1.4.1 材料处理选用来自同一单株的成熟、饱满茎豆，统一浸种72 h，每6 h换水一次，待茎豆萌动露白后，转入培养皿中，进行生根培养(底部铺设双层滤纸)，待茎豆芽点基部生出白色的吸水根时，即可进行取样制片。所有材料试验均在20～22 ℃培养箱中进行，所有材料均设置生物学重复试验3次。

1.4.2 染色体制片和计数主要参考Han等[10]的方法，并根据油莎豆的茎豆生长特点进一步优化后制定，具体的方法为：(1)待样品根尖长度达到2～3 cm时进行剪根。剪根前，事先准备0.5 mL顶端扎孔的离心管，并在实验前将管内用水润湿。将剪下的根尖放入管中插入冰内；(2)将装有根尖的离心管放置于充气罐内，充入0.9～1.0 MPa的N2O，静置处理2 h；(3)在冰浴条件下，将90%预冷冰乙酸加入离心管内，静置处理10 min，用胶头滴管将冰乙酸吸出，并用ddH2O进行2次清洗；(4)用刀片将根尖白色部分切下，放入装有25 μL酶液的0.5 mL离心管中。酶液为纤维素酶与果胶酶3∶1混合，酶解在37 ℃水浴条件下进行1 h(具体时间可根据根尖大小调整)；(5)用70%的酒精将根尖清洗3次，并用解剖针将根尖在剩余酒精中充分破碎和震荡，4 000 r/min离心，将细胞离心至管底后，通过倒置和晾干将剩余酒精从离心管中移除；(6)根据根尖数量，在离心管内加入25～45 μL冰乙酸，瞬时离心后，充分震荡混匀。将洁净的载玻片放置在预先准备的湿润的盒子中，室温保持在23 ℃左右。从离心管中吸取8 μL细胞悬浮液，在距离载玻片一定距离的正上方滴下，随后立即将盒子盖上，直到细胞散开，载玻片晾干后取出；(7)将染色体标本在普通光学显微镜或相差显微镜下进行镜检，找到目标分裂相保存备用，在避光状态下，滴加荧光染料DAPI，加上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封固，备用；(8)用荧光显微镜观察染色体数目和核型。确定每个染色体数目时，所观察的分裂相数目不低于20个。

1.5 端粒荧光杂交试验

根据Tang等[11]方法，利用端粒特异性探针Telo对油莎豆材料有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交试验。端粒特异性探针Telo(TTTAGG-GTTTAGGGTTTAGGG)由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用6-carboxyfluorescein (6-FAM)对探针序列进行绿色荧光标定，其合成按照Lang等[12]报道的方法。 由于细胞会在试验过程中出现破碎和解体情况，DAPI杂交和端粒杂交试验可能会用样本不同的细胞开展。

1.6 数据处理

试验数据的显著性分析采用软件SPSS(20.0)的最小显著性法(LSD)进行处理。

2 结果与分析

2.1 3种油莎豆主要农艺性状比较

3个材料粒色均为深棕色，其他形态学性状测定的表型见表1。产量直接相关的分蘖数、单粒重和单株结豆数3个性状在材料间的差异显著。其中，‘豫油莎3号’分蘖数最高，分别是‘豫油莎2号’的2.1倍、‘YYS-4’的1.5倍；‘YYS-4’的单粒重则最高，是其他两个材料的2倍以上；单株结豆数‘豫油莎3号’达245个，分别是‘豫油莎2号’、‘YYS-4’的1.3倍和1.6倍；粒长和粒宽属于单粒重的亚性状，在3个材料间的表现与粒重基本一致，并均以‘YYS-4’最高，‘豫油莎2号’粒宽高于‘豫油莎3号’，但粒长值则相反。其他性状均以‘豫油莎2号’的检测值为3个材料中最高。

2.2 3种油莎豆主要品质相关性状比较

3个油莎豆的品质性状见表2。其中，蛋白质含量以‘YYS-4’最高(7.63%)，‘豫油莎2号’最低(4.70%)；油分含量以‘豫油莎2号’最高，达32.00%，‘豫油莎3号’和‘YYS-4’基本相同；淀粉含量在3份供试材料中都在30%以上，其中‘YYS-4’最高，达36.7%；可溶糖含量以‘豫油莎3号’最高(21.30%)，‘YYS-4’也表现出较高的糖分含量(19.28%)；总灰分含量以‘豫油莎2号’最高(4.40%)，‘YYS-4’最低(1.80%)。

2.3 3种油莎豆主要光合特性比较

叶绿素荧光测定结果显示(表3)，‘豫油莎2号’的最大光化学效率(Fv/Fm)最高(0.800)，显著高于‘豫油莎3号’和‘YYS-4’(分别为0.783和0.778)；实际光量子效率(PS Ⅱ)以‘豫油莎2号’最高，为0.739；热耗散能力即非光化学淬灭系数(NPQ)以‘豫油莎2号’最小(1.129)，‘YYS-4’最高(1.416)；电子传递效率(ETR)在 3个材料差异较小。

3个油莎豆材料光合性能表现为：胞间 CO2浓度(Ci)以‘豫油莎2号’最低(293.00 μmol·mol-1)，‘YYS-4’材料最高(336.25 μmol·mol-1)；3个材料的气孔导度(Gs)变幅为261.67～338.50 mmol·mol-1，并以‘YYS-4’最大、‘豫油莎2号’最小；叶片净光合速率(Pn)以‘豫油莎2号’最高(18.17 μmol·m-2·s-1)，‘YYS-4’材料最低(15.13 μmol·m-2·s-1)；蒸腾速率(Tr)和水分利用率(WUE)是相互关联的2个参数，‘豫油莎2号’和‘豫油莎3号’的蒸腾速率较低，相对应的水分利用率均显著高于‘YYS-4’。

2.4 3种油莎豆染色体数目比较

3份供试材料根尖有丝分裂中期细胞染色体压片和DAPI荧光染色的结果显示，3个材料的染色体数目均为156条，长度为0.5～1.2 μm(图2)，3种材料的生物学重复试验结果也均无差别。

表1 3种粒型油莎豆材料的主要农艺性状

表2 3种粒型油莎豆材料的品质性状

表3 3种粒型油莎豆材料的光合性状

为了进一步确认DAPI染色结果，对3份供试材料根尖的有丝分裂中期细胞染色体进行端粒序列荧光原位杂交。结果显示，‘豫油莎3号’、‘豫油莎2号’和‘YYS-4’的染色体数目均为156条(图3)，与DAPI染色后计数的结果相同。生物学重复试验结果也完全一致。由此，确认3份供试材料染色体数目相同，且均为156条。

3 讨 论

油莎豆起源于非洲[1]，20世纪50年代中国将其作为油料作物引入国内。有正式记载的引种分别是1952年的前苏联、1960年的保加利亚和20世纪70年代的朝鲜大粒类型[2]，中国的油莎豆种质经过数十年的种质交流和自留种，各省、地区油莎豆材料的来源和谱系资料混乱。目前，油莎豆尚未发现可用的杂交种，相比可杂交的其他植物，油莎豆育种更加依赖现有种质资源的初始综合农艺性状。从地上部形态看，油莎豆叶型基本分为宽叶、细叶两种类型；粒色共有黄、棕、黑、红共4种颜色[13]，中国现有资源以棕色和黄色占绝大多数，少数资源呈现黑色和红色。而与产量直接相关的粒型性状可分为中长粒、中圆粒、大粒3种类型，本研究对3种粒型油莎豆的农艺性状和品质分析可为今后的育种和应用提供参考。

3种材料的多个形态学性状和品质性状差异显著。其中，‘YYS-4’材料单株产量水平最高(297 g)，‘豫油莎2号’和‘豫油莎3号’分别为113.46 g和90.65 g；‘豫油莎3号’是典型的细叶、多分蘖类型材料，‘豫油莎2号’则表现为典型的宽叶型材料。从品质方面看，‘豫油莎3号’可溶糖达到了21.30%，是高糖型品种，‘豫油莎2号’和‘YYS-4’材料分别是高油型和高淀粉型材料。

光合作用是植物的生命之源，能较好地说明该物种对光、温、水气等环境资源的转化效率[14]。本研究结果显示，‘豫油莎2号’在光合参数方面表现较为突出，其叶片净光合速率在3类粒型中最高，显示了该材料较高的产量潜力。目前，油莎豆的光合相关性状研究国内外正式报道较少，本结果可为后续的相关研究提供参考。

Roalson[8]对莎草科的31属851种的染色体数目研究进行了汇总，发现莎草科物种存在明显的种内染色体数目差异，31属851种中，共发现4 231个不同的单倍体染色体数目，莎草科不同种的单倍体染色体数目中频率最高的是30、28和29，其次为5、10、20和35，最高的为114条。莎草属不同种间的单倍体染色体数分布较为分散，在8、18、32、36、40、48、52、54和56处相对集中，数目最少为6条，最多为114条[8，15-19]。油莎豆种内同样存在不同染色体条数的报道[8]，其中，Heiser[20]报道了一种二倍体油莎豆具有108条染色体；Suzuka等[21]发现了染色体数为18的二倍体材料；有的研究报告则认定其获得的油莎豆染色体数目为208条，同时也鉴定了单倍体的染色体为104条[8]；Rath等[8,22]报道了其发现的两种材料的单倍体染色体数均为54条；Mulligan等[23]在加拿大的安大略发现了一种n=48的油莎豆材料。然而，Zonneveld认为以上各报道的油莎豆染色体数目结果的准确性仍有待进一步商榷[9]。本研究通过DAPI染色和端粒探针荧光原位杂交两种方法确认了中国现有3种粒型油莎豆材料的染色体数目均为156条，这一结果与前人报道不同。其原因可能有：(1)油莎豆为无性繁殖植物，发生染色体自然加倍、着丝粒断裂、融合等的突变后的个体相比有性繁殖植物更容易存活，经过长期固化、繁衍后产生了多样性丰富的染色体数目类型；(2)种内突变株的衍生使油莎豆资源产生明显的地域分化，各国学者研究选用的研究材料本身来源不同，造成了结果的差异。确切的结论需要今后更多的试验数据给予证实。