‘金冠’苹果及其优系(SGP-1)果实发育期间有机酸代谢特征比较

杨文渊，谢红江，陶 炼，宦云敏，陈善波，林立金，廖明安*

(1 四川农业大学 园艺学院，成都 611130；2 四川省农业科学院园艺研究所，成都610066；3 农业部西南区域园艺作物生物学与种质创制重点实验室，成都 610066；4 四川省林业科学研究院，成都 610081)

果实中有机酸的代谢是一个复杂的生理过程，包括酸的合成、降解、利用及区域化的平衡，且有机酸含量及组分比例是决定果实酸度及风味的重要组成因子[1]。因此，揭示果实中有机酸的调控机制对果实品质调控及良种培育具有重要的意义。苹果成熟果实中有机酸以苹果酸为主，占60%以上，高的可占97%[2-4]，奎宁酸、柠檬酸、酒石酸、莽草酸、琥珀酸等含量低[5-6]。通常有机酸在果实生长过程中积累，在成熟过程中作为糖酵解、三羧酸循环(TAC环)等呼吸基质，以及糖原异生作用基质而被消耗，其合成和降解过程是在酶促反应下进行的。苹果果实中苹果酸的积累受代谢关键酶调控，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和苹果酸脱氢酶(MDH)负责苹果酸合成，苹果酸酶(ME) 和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)负责苹果酸的降解，液泡膜上的2个质子泵H+-ATPase(VHA)和H+-焦磷酸酶(VHP)为苹果酸的跨膜运输提供能量，目前已在苹果[1,7-9]、欧李[10]、杏[11]、桃[12-13]等多种果实中证实以上6种代谢相关酶活性是影响苹果酸积累速率的决定因素，但它们具体的作用机制还不太清楚。

经过多年生产实践，发现‘金冠’苹果自然变异材料1份(暂定名‘SGP-1’)，具有低酸、少锈、耐贮藏等优良性状，弥补了‘金冠’苹果易感锈、果酸味浓、易发绵等不足。本研究拟通过测定‘金冠’苹果及其优系‘SGP-1’果实发育期间有机酸组分和含量以及苹果酸代谢相关酶活性，分析有机酸含量变化规律及其与苹果酸代谢相关酶的关系，明确有机酸积累的关键时期和关键酶，探讨‘金冠’和‘SGP-1’果实全发育期有机酸积累的生理差异，为调控苹果果实酸度提供理论依据，也为深入研究‘SGP-1’果实有机酸代谢的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 参试材料及样品采集

供试材料为四川省阿坝州苹果园‘金冠’苹果及其优系‘SGP-1’的果实。在2019年4～9月，选取生长势基本一致的3株苹果树进行样品采集，在花后7 d开始采集样品，以后每20 d取1次样，直至果实达到生理成熟(花后160 d左右)，1共取9次样。幼果期至成熟期果实大小差异较大，因此每次取果量应根据果实大小而定。样品采集后，果实带皮去心切碎，迅速用液氮冷冻(-196 ℃)后混匀，分两份置于超低温冰箱(-80 ℃)备用，一份用于检测有机酸组分及含量，另一份用于分析苹果酸代谢酶活性。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 果实中酸组分及含量果实中酸组分提取和测定参照刘雅兰[14]、张丽丽等[15]的方法并略加改进。称取液氮研磨成粉的果肉2 g左右(计重)，加入4 mL 0.2%偏磷酸，摇匀，常温超声提取20 min，8 500 r/min离心10 min，残渣中再加入4 mL偏磷酸再次提取，合并上清液并定容到10 mL，经0.45 μm滤膜过滤，获得样品提取液待测。色谱条件：Agilent高效液相色谱仪(Agilent1260Ⅱ)，色谱柱为C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为纯甲醇：0.02 mol/L K2HPO4(pH 2.6)= 3∶97，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。色谱纯级的标准样品苹果酸、奎宁酸、柠檬酸和酒石酸由Sigma公司提供，用超纯水分别制备成系列混合标准溶液。将系列混合标准溶液经0.45 μm 微孔滤膜过滤到2 mL进样瓶中，进样后以峰面积(X)对浓度(Y)求回归方程和相关系数。将处理后的样品提取液进行液相色谱分析，进样量为10 μL，采用外标法定量。有机酸含量为各酸组分相加之和。

1.2.2 果实中苹果酸代谢相关酶活性样品酶提取液制备参照 Hirai 等[16]和 Sadka 等[17]的方法。将0.5 g 果肉用 3 mL 的提取缓冲液[0.2 mol·L-1Tris-HCl 缓冲液(pH=8.2)、0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1异抗坏血酸]在冰上匀浆，8 000 g、4 ℃离心 10 min，取上清液置冰上，用于酶活性的测定。按照酶试剂盒说明书分别测定MDH、PEPC、ME、PEPCK、VHA和VHP活性，采用酶标仪分光光度法测定吸光度(OD)值变化，每30 s记录1次OD值，重复3次(1 min为1次重复)，共记录3 min，以每分钟OD值变化0.01为1个酶活单位(U)，酶的活性以单位每克鲜果肉每分钟表示(U·g-1·min-1)。

1.3 数据统计分析

用 Excel 2010 软件进行数据整理和绘图，测定结果以平均值±相对标准偏差表示，应用 SPSS20 进行差异显著性分析(Duncan’s新复极差法，0.05水平上测试)和相关性分析(Pearson法)。

2 结果与分析

2.1 ‘金冠’及‘SGP-1’果实发育过程中主要有机酸含量比较

2.1.1 有机酸含量在整个果实发育期，‘SGP-1’果实有机酸含量始终显著低于‘金冠’果实；二者果实有机酸含量随发育期的变化趋势基本一致，均先升后降，并在花后27 d达到最高值，分别达到21.17 mg·g-1和23.74 mg·g-1(图1)。其中，‘SGP-1’有机酸含量在花后47～67 d快速下降，降幅在50%左右，在花后87～127 d有机酸含量趋于稳定；在成熟期(花后127～167 d)，‘SGP-1’和‘金冠’果实有机酸含量分别急剧下降至0.70 mg·g-1和1.40 mg·g-1，分别仅为峰值的3.31%和5.90%。总之，两材料果实有机酸含量随发育期的变化趋势相似，但‘SGP-1’下降较早且快，自花后67 d开始，‘SGP-1’有机酸含量仅为‘金冠’的一半，并持续到果实成熟。

2.1.2 苹果酸、奎宁酸、酒石酸和柠檬酸含量‘SGP-1’和‘金冠’果实有机酸主要由苹果酸、奎宁酸、酒石酸和柠檬酸组成，幼果期均以奎宁酸为主，分别占比87.40%和64.00%，成熟期均以苹果酸为主，分别占比50.10%和74.20%。

首先，在整个苹果果实发育期，‘SGP-1’果实苹果酸含量始终显著低于‘金冠’，仅为‘金冠’的8.4%～67.4%(图2，A)。在幼果期(花后7～47 d)和膨大期(花后67～107 d)，二者果实苹果酸含量变化趋势不同，‘SGP-1’在花后7 d达到峰值(4.15 mg·g-1)，而后急剧下降至0.83～1.01 mg·g-1之间；而‘金冠’苹果酸含量幼果期快速上升，于花后47 d达到最高值(9.88 mg·g-1)，随后缓慢递减，在花后107～127 d趋于稳定。在成熟期(花后127～167 d)，两材料苹果酸含量均急剧下降，仅为峰值的10%左右，此时‘SGP-1’苹果酸含量是‘金冠’的1/3。可见， ‘SGP-1’苹果酸积累的关键时期为果实发育初期，而‘金冠’苹果酸积累关键期是幼果期和膨大期。

同时，‘SGP-1’和‘金冠’果实中奎宁酸和酒石酸含量变化趋势一致，总体呈现先升后降的特征(图2，B、C)。在幼果期，‘SGP-1’果实两种酸含量大多显著高于‘金冠’，且峰值均出现在花后27 d；‘SGP-1’和‘金冠’果实奎宁酸含量峰值分别为18.49 mg·g-1和15.19 mg·g-1；‘SGP-1’奎宁酸含量在幼果期比‘金冠’高出21.81%～37.41%(图2，B)，弥补了其苹果酸含量的不足(图2，A)，使得两材料有机酸整体含量变化趋于一致(图1)。在以后发育期，两材料果实奎宁酸和酒石酸含量均快速减少，至成熟期两材料间差异不显著。

另外，在整个果实发育期，‘SGP-1’和‘金冠’果实中柠檬酸含量变化趋势一致(图2,D)。在果实发育初期，‘SGP-1’柠檬酸含量显著高于‘金冠’，并在花后7 d就达到峰值(0.67 mg·g-1)，而后大幅下降；在花后67～87 d，‘SGP-1’柠檬酸含量显著低于‘金冠’；在成熟期，二者柠檬酸含量趋于一致，差异不显著。

2.2 ‘金冠’及‘SGP-1’果实发育过程中酸代谢相关酶活性比较

2.2.1 MDH和PEPC活性‘SGP-1’和‘金冠’果实中MDH活性在果实发育过程中整体呈‘U’型变化，幼果期和成熟期MDH活性较高，膨大期活性较低(图3,A)。其中，两材料MDH 活性峰值出现时间不同，分别在花后47 d(52.42 U·g-1·min-1)和167 d(36.68 U·g-1·min-1)；除花后87 d和167 d外，其余时段两材料MDH活性差异达到显著水平。在幼果期，两材料MDH活性变化趋势相反，且‘SGP-1’中的MDH活性是‘金冠’的2倍左右，说明在幼果期‘SGP-1’苹果酸的合成途径更活跃。

同时，‘SGP-1’和‘金冠’果实中PEPC活性变化趋势一致，均整体上先降后升，峰值均出现在花后7 d，分别为21.13 和17.10 U·g-1·min-1(图3,B)。在幼果期，‘SGP-1’中PEPC活性显著高于‘金冠’，最大差距为4倍，且降幅远小于‘金冠’；‘金冠’PEPC活性仅在花后107 d快速回升并显著高于‘SGP-1’，而后又快速下降，至成熟期，两材料PEPC活性均快速增加，并趋于一致，差异不显著。

2.2.2 ME和PEPCK活性由图4,A可知，‘SGP-1’和‘金冠’果实中ME活性随着生育期的变化趋势基本一致，在幼果期最高，后随着果实发育快速下降，而在膨大期和成熟期又有所回升；整个发育期出现3个小高峰，最大值在花后27 d，‘SGP-1’和‘金冠’分别为42.36 和27.04 U·g-1·min-1。‘SGP-1’的ME活性在花后7～87 d显著高于‘金冠’，差距在2～3倍；在花后107 d，‘金冠’的ME活性快速上升，显著超过‘SGP-1’；在果实成熟时，两材料的ME活性差异达到显著水平。

同时，两材料果实中PEPCK活性随发育期的变化趋势也基本一致，在幼果期最高，并在花后27 d达到峰值，‘SGP-1’和‘金冠’分别为56.65 和38.50 U·g-1·min-1，而后快速下降，成熟期略有所回升(图4,B)。‘SGP-1’的PEPCK活性在幼果期显著高于‘金冠’，而在成熟期显著低于‘金冠’。

2.2.3 VHA和VHP活性‘SGP-1’和‘金冠’果实中质子泵VHA活性随生育期的变化趋势基本一致，整体呈“W”型，在发育初期、膨大期和成熟期出现3个小高峰(图5，A)。其中，‘SGP-1’果实的VHA活性在花后7～87 d显著高于‘金冠’；之后，随着果实发育，‘SGP-1’的VHA活性先下降后上升，在花后87 d达到最大值而后持续下降；到成熟时显著低于‘金冠’，仅为‘金冠’的三分之一。

同时，由图5，B可知，两种材料果实的质子泵VHP活性变化趋势也一致，随着果实发育先上升后下降再上升，并在幼果期和成熟期表现出较高活性。

表1 ‘金冠’和‘SGP-1’果实苹果酸与其代谢相关酶活性的相关系数

‘SGP-1’果实VHP活性在幼果期显著高于‘金冠’，从花后67 d开始则显著低于‘金冠’；特别在花后107 d至成熟期，‘金冠’果实中VHP活性快速增加，一直保持较高水平，显著高于‘SGP-1’，约是‘SGP-1’的2～3倍。

2.3 ‘金冠’及‘SGP-1’果实苹果酸含量与其代谢酶活性的相关性

相关性分析表明(表1)，在幼果期(花后7～47 d)，‘SGP-1’苹果酸含量与PEPC和VHA活性呈极显著正相关，与MDH活性呈显著负相关，而‘金冠’苹果酸含量与MDH、PEPC和VHA活性均呈极显著负相关；在果实膨大期(花后67～107 d)，‘SGP-1’苹果酸含量与MDH、PEPC活性呈极显著负相关，与PEPCK、VHA活性呈显著正相关，而‘金冠’苹果酸含量则与PEPC、ME、VHP活性呈极显著或显著负相关；在成熟期(花后127～167 d)，‘SGP-1’苹果酸含量与MDH、PEPC、ME、VHA和VHP活性均呈极显著或显著负相关，而‘金冠’苹果酸含量则与MDH、PEPC、ME和VHP均呈极显著或显著负相关。由此可知，对‘SGP-1’和‘金冠’苹果酸积累起主要调控作用的关键酶在幼果期和膨大期存在较大差异，幼果期负责苹果酸合成的关键酶不同，而膨大期负责苹果酸降解和运输的关键酶不同，成熟期基本一致。

3 讨 论

本研究对‘SGP-1’和‘金冠’苹果果实发育过程中有机酸及各组分含量变化进行了分析，二者差异达到显著水平。特别是‘SGP-1’苹果酸含量变化规律与‘金冠’相反，至成熟时只有‘金冠’的三分之一；加之，‘SGP-1’来源于‘金冠’变异优系，二者遗传背景相似，从果实发育期间各酸组分含量、苹果酸代谢关键酶活性及相关关系，探讨果实发育过程中降酸途径及 ‘SGP-1’果实低酸成因，对高糖低酸新品种培育具有重要意义。

本研究发现‘SGP-1’果实中主要影响苹果酸合成(MDH、PEPC)、降解(ME、 PEPCK)和转运(VHA和VHP)的关键酶活性，在幼果期均显著高于‘金冠’，并没有带来‘SGP-1’果实苹果酸的高积累，反而显著低于‘金冠’；而且苹果酸含量与两个主要合成酶活性呈负相关关系，表明合成只是苹果酸积累的前提但不是唯一的因素，高的合成不能直接导致高的积累。这与姚玉新[7]在苹果中的研究结论一致。Beruter[18]研究也发现在高酸和低酸的“Usterapfel”苹果成熟过程中两种合成酶活性没有差异。可见，苹果酸合成不是果实酸度差异形成的关键因素，而参与降解的ME、PEPCK和为运输提供能量的VHA和VHP的协同调控对苹果酸含量变化及果实酸度差异形成起关键作用。

本研究结果表明负责苹果酸降解的ME和PEPCK活性，在‘SGP-1’幼果期快速升高，且显著高于‘金冠’，导致幼果期‘SGP-1’苹果酸快速下降，积累偏少；而成熟期两种材料苹果酸含量急剧下降也伴随有上述酶活性的回升，说明ME和PEPCK对两种材料苹果酸含量的下降起到重要作用，与前人在苹果[7,19-20]、李[21]、樱桃[22]上的研究结果一致。但它们是否受控制苹果果实低酸性状基因的调控，以及这些关键酶的作用都需进一步研究。

质子泵VHA和VHP为有机酸跨膜运输提供能量[23]，对果实液泡有机酸的贮藏起到了关键作用，为代谢产物和离子的次级运输提供能量[24]。本研究结果表明VHA和VHP的活性在果实发育过程中出现了3个小高峰，相关性分析也说明质子泵活性直接影响着苹果酸的积累，幼果期和膨大期VHA发挥主要作用，而成熟期VHP作用更显著。相似的研究在苹果[7]、柑橘[25]、葡萄[26]和梨[27]上也被发现。特别是在‘金冠’苹果果实成熟过程中两质子泵活性显著升高，增量大于‘SGP-1’，说明在酸度高的‘金冠’苹果成熟过程中，需要提供更多能量来实现对苹果酸的调节。但关于两个质子泵是如何调节果实酸度、果实有机酸的跨膜运输及调控机理等，还有待深入研究。

果实有机酸代谢是一个极为复杂的过程，不同果实中控制果实有机酸含量的分子机制至今还不完全清楚。前人从分子水平研究了控制李[28]、苹果[29]果实酸度候选基因，为调控果实酸度奠定了基础，针对‘SGP-1’与‘金冠’果实酸度的显著差异和不同发育期起主要调控作用的关键酶不同，下一步可深入挖掘了‘SGP-1’果实酸度调控的关键基因，并分析它们的功能，对改善果实品质具有重要意义。

4 结 论

本研究证实了‘SGP-1’是以苹果酸为主的低酸型‘金冠’苹果变异优系，该发现为深入研究果实低酸形成机理和培育高糖低酸新品种奠定了基础。本研究还发现‘SGP-1’苹果酸积累的关键时期为果实发育初期，并在幼果期就快速下降；而‘金冠’苹果酸积累关键期是幼果期和膨大期，至成熟期才快速下降。‘SGP-1’苹果酸代谢相关酶活性在幼果期均显著高于‘金冠’，成熟期持平或显著低于‘金冠’；二者幼果期负责苹果酸合成的关键酶不同，膨大期负责苹果酸降解和运输的关键酶不同，成熟期基本一致。