肉桂醛调控不结球白菜多胺氧化酶-过氧化氢系统缓解硒胁迫的机理研究

杨会敏，王 旭，郝旖旎，石志琦，陈 健，杨立飞*

(1 南京农业大学 园艺学院，南京 210095； 2 江苏省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，南京210014；3 南京农业大学 和县新农村发展研究院，安徽和县 238200)

硒(selenium，Se) 是动植物生长发育所需的重要微量营养元素之一，它既有益又有害，这种双重效应之间的界限非常狭窄，并且在物种之间有所不同[1]。鉴于硒对人体健康的重要性，人们开始越来越多地关注富硒农产品[2]。然而持续施用硒肥增加了农业生态系统中硒的释放量，对作物生长造成潜在危害[3]。此外，灌溉、采矿、炼油、化石燃料燃烧和工业废水排放等人类活动也造成了环境中硒污染程度增加[4]。因此，了解植物如何与过量硒反应的机制对于植物、人类和动物营养以及降低环境中硒污染的风险非常重要。

硒胁迫扰乱植物的生理状态，进而阻碍植物的生长发育。活性氧(reactive oxygen species，ROS)过量累积诱导的氧化应激是植物响应逆境胁迫的重要作用方式[5-6]。过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)是ROS的典型代表之一[7]，其含量超过氧化还原反应和细胞信号传导所需的正常生理水平时，会导致细胞损伤和细胞死亡[8]。植物细胞中，H2O2产生与多胺(polyamines，PAs)代谢密切相关。多胺主要包括腐胺(putrescine，Put)、亚精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)[9]。多胺氧化酶(polyamine oxidases，PAO)分解代谢Spd或Spm生成H2O2，是植物中H2O2的重要生物合成途径[10]。当植物处于逆境条件下，PAO活性会显著增加，以降低逆境诱导的细胞内高H2O2水平累积的PAs，导致ROS爆发，进而导致细胞死亡[11]。我们前期研究发现，硒胁迫能够诱导不结球白菜体内PAO介导的H2O2累积，进而导致细胞损伤和生长受阻[12]。因此，PAO-H2O2系统可能是调控植物耐硒的作用靶点之一。

肉桂醛(cinnamaldehyde，CA)，是一种醛类有机化合物，是肉桂精油的主要成分。肉桂醛是一种环境友好型植物源天然化合物，具有抗氧化[13]、抗癌[14]、抑菌[15]等多种功能。但是肉桂醛在植物生理调节中的作用鲜有报道。本实验室前期工作发现肉桂醛可以抑制疫霉菌生长、缓解植物重金属镉胁迫伤害[16-17]，这些发现启示我们探究肉桂醛调控植物抗性生理抵御硒胁迫的可能性。

本研究以不结球白菜(Brassicarapa)幼苗根为材料，结合生理生化试验手段，研究肉桂醛调控不结球白菜PAO-H2O2系统缓解硒胁迫作用方式，旨在为揭示植物源天然化合物肉桂醛缓解植物硒毒害的作用机制提供理论基础，并为农业生态环境中硒肥的合理施用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料和试剂

供试不结球白菜(品种‘四月慢’)种子购自南京绿领种业有限公司。将种子用1% NaClO消毒10 min后，用单蒸水冲洗3遍，浸泡2 h后将其置于黑暗的塑料网上发芽。待根长1.5 cm时，挑选生长一致的幼苗，转至1/4 Hoagland 营养液中培养，并在其中加入不同试剂进行处理。光照培养箱培养条件为：温度(25±1) ℃、光周期16 h(昼)/8 h(夜)，相对湿度75%，光照强度200 μmol·m-2·s-1。供试药剂肉桂醛购于国药集团化学试剂有限公司，纯度大于95%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解并配制成母液，密封保存备用；其他常规化学试剂为分析纯。

1.2 试验设计

试验1: 设置梯度浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)(0、 5、10、20、40和80 μmol·L-1)处理不结球白菜幼苗根，每个处理64株幼苗，3次重复。处理72 h后测定根长，筛选出能够诱导抑制根长50%的硒处理浓度。

试验2：在上述筛选出的硒浓度处理下，添加梯度浓度肉桂醛(0、10、50、100、200和300 μmol·L-1)处理不结球白菜幼苗根，每个处理64株幼苗，3次重复。处理72 h后，测定根长，筛选出能够有效缓解硒胁迫的最佳肉桂醛浓度。

试验3: 根据上述筛选出的硒浓度和肉桂醛浓度，设置以下4个处理：①对照(CK)；②Se处理；③Se+CA处理；④CA处理。每个处理64株幼苗，3次重复。处理72 h后取根，用单蒸水冲洗3次后，吸干表面水分，测定各项生理生化指标。

1.3 测定指标及其方法

1.3.1 生长指标取不同处理后的幼苗，用直尺测定根长 (每个处理选取30株长势均一的幼苗，作为30次重复)，采用电子天平测量根鲜重(每个处理3次重复，每次重复选取10株长势均一的幼苗)。

1.3.2 丙二醛(MDA)荧光染色将处理幼苗根尖用单蒸水漂洗干净，置于10 μmol·L-1的 C11 BODIPY 581/591溶液中染色10 min(25 ℃，避光)，然后用单蒸水冲洗 3 次，置于荧光显微镜下观察红色荧光并拍照，每个处理3次重复。采用 Image-Pro Plus 6.0分析计算MDA相对荧光密度。

1.3.3 MDA含量参照McCord等[18]的方法，取 0.1 g 根置于预冷的研钵中，研磨至匀浆，加入 1.6 mL 10%三氯乙酸(TCA)，4 000 r/min离心 10 min，所得上清液即为待测液。以 10% TCA 为对照，取 1.5 mL 上清液加入 1.5 mL 0.67%的硫代巴比妥酸，沸水浴30 min，迅速置于冰上冷却，再次离心取上清液，分别在 450 、532 和 600 nm波长下测定吸光值A450、A532和A600。每个处理3次重复，根据以下公式计算丙二醛(MDA)含量。MDA(μmol/g)=[6.45×(A532-A600)-0.56×A450] ×V/(1000×W)。式中，V和W分别为提取液体积和植物样品重量。

1.3.4 细胞死亡检测参照Kellermeier等[19]的方法，检测方法同1.3.2，只是将10 μmol·L-1的 C11 BODIPY 581/591溶液中染色10 min改为2 μmol·L-1的PI 溶液染色20 min。

1.3.5 H2O2荧光染色参照Yamamoto等[20]的方法，检测方法同1.3.2，只是将10 μmol·L-1的 C11 BODIPY 581/591溶液中染色10 min改为5 μmol·L-1的BES-H2O2-Ac溶液染色15 min。

1.3.6 H2O2含量采用试剂盒(A064-1，南京建成生物工程研究所) 检测H2O2含量。

1.3.7 PAO活性参照汪天等[21]的方法，反应体系包含1.5 mL磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 6.5)，0.2 mL显色液(100 mL磷酸缓冲液中含有4-氨基氨替吡啉(10 mg)和25 μL N, N-二甲基苯胺)，0.1 mL辣根过氧化物酶，0.2 mL酶提取物，最后加入0.1 mL底物Spd(20 mmol·L-1)或Spm(20 mmol·L-1)催化反应。每个处理3次重复，以每分钟515 nm吸光值变化0.01为一个酶活单位。

1.3.8BrPAOs家族基因表达分析采用QIAGEN总RNA提取试剂盒提取根总RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(TakaRa)用于合成cDNA的第一链。根据TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa)说明，利用ROCHE(LightCycler®480 Ⅱ)进行基因定量表达分析；基于2-ΔΔCt方法计算表达数据。以Actin的相对转录丰度作为内标。每个处理表达水平是对照的相对值。设计用于基因扩增的引物见表1。

1.4 数据统计分析

根据不同实验设计，采用3～30次生物学重复的平均值±标准差(SD)对实验结果进行单因素方差分析(One way ANOVA)，F检验分析不同处理之间的差异显著性(P<0.05)。采用Excel软件处理数据并作图。针对每一个测定的生理参数，计算出处理后相较于对照的变化倍数(log2)，然后采用TBtools软件中的HeatMap绘制聚类分析热图。对于同一种处理方式的不同生理参数，采用R语言程序下的corrplot程序包进行Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 硒对不结球白菜幼苗根系生长的影响

各浓度水平的硒均显著抑制不结球白菜幼苗根系生长，并呈现浓度效应，其根长和根鲜重随着硒浓度的增加而显著下降(图1)。其中，在5、10、20、40和80 μmol·L-1硒胁迫处理下，根长分别比对照显著降低 24.5%、33.5%、50.2%、58.8% 和 71.8%(图 1，A)，根鲜重分别比对照降低11.7%、34.4%、49.4%、62.3%和71.2%(图 1，B)。20 μmol·L-1硒胁迫对幼苗根长和根鲜重具有显著抑制作用，抑制率均约为50%。因此，选择其用于后续试验。

2.2 肉桂醛对硒胁迫下不结球白菜幼苗根系生长的影响

图2显示，各浓度肉桂醛均可以显著缓解硒胁迫对不结球白菜幼苗根系生长的抑制作用，并且呈现浓度效应。其中，在10、50、100、200和300 μmol·L-1的肉桂醛处理下，幼苗根长分别比20 μmol·L-1硒处理增加9.1%、40.6%、25.0%、10.0%和3.1%(图 2，A)；50 μmol·L-1的肉桂醛对硒胁迫造成的根系生长抑制具有显著缓解作用且效果最佳，因此选择50 μmol·L-1的肉桂醛(CA50)用于后续试验。

同时，时间效应显示，从处理6 ～72 h，4个处理幼苗根长均逐渐增加，但根长始终表现为CK>CA50>Se+CA50>Se处理，且处理间差异在各时期均达到显著水平；在幼苗处理72 h后，3个处理的幼苗根长与CK相比均显著降低，CA50处理比CK降低2.4%，而CA50处理比Se、Se+CA50处理分别显著增加72.1%和21.2%，Se+CA50处理的幼苗根长又比Se处理显著增加42.0%(图 2，B、C)。

另外，各处理幼苗根鲜重的表现与根长相似，各处理幼苗根鲜重均显著低于对照，CA50处理比CK降低15.4%； CA50处理比Se、Se+CA50处理分别显著增加37.6%和19.5%，Se+CA50处理又比Se处理显著增加15.1%(图 2，D)。以上结果表明，外源添加肉桂醛能够有效逆转硒胁迫对不结球白菜幼苗造成的生长抑制。

2.3 肉桂醛对硒胁迫下不结球白菜幼苗氧化损伤的影响

不结球白菜幼苗根尖MDA荧光亮度在Se处理下明显强于CK，添加CA50后其亮度有所减弱(图3，A)。Se 处理对幼苗造成了氧化损伤，其根尖MDA荧光密度是CK的1.4倍；与Se处理相比，Se+CA50处理MDA荧光密度显著降低24.7%；CA50处理MDA荧光密度与CK差异不显著(图 3，B)。同时，与CK相比，Se处理后幼苗根尖MDA含量涨幅达到1.3倍，而Se+CA50处理MDA含量比Se处理显著降低46.3%；CA50处理MDA含量与CK、Se+CA50处理相比均差异不显著(图 3，C)。以上结果表明，肉桂醛能够显著减少硒胁迫导致的不结球白菜幼苗的氧化损伤。

2.4 肉桂醛对硒胁迫下不结球白菜幼苗细胞死亡的影响

与CK相比，Se 处理不结球白菜幼苗根尖荧光亮度较强，相对细胞死亡率高达CK的1.8倍；添加CA50后荧光亮度明显减弱，相对细胞死亡率降低15.9%；CA50处理根尖相对细胞死亡率显著低于Se和Se+CA50处理，降幅分别为59.6%和51.9%，但与CK差异不显著(图 4，A、B)。以上结果表明，肉桂醛能够显著减少硒胁迫导致的不结球白菜幼苗根尖细胞死亡。

2.5 肉桂醛对硒胁迫下不结球白菜幼苗H2O2含量的影响

Se处理不结球白菜幼苗根尖H2O2荧光亮度显著高于CK，添加CA50后H2O2荧光亮度明显减弱，但仍强于对照，表明硒胁迫对幼苗造成了H2O2累积，而CA50能明显降低H2O2累积(图5，A)。同时，通过计算可知，Se处理幼苗根尖H2O2荧光密度比CK涨幅达到1.3倍，添加CA50使H2O2荧光密度显著降低27.0%，CA50处理H2O2荧光密度显著低于Se和Se+CA50处理，分别降低了40.3%和18.2%(图 5，B)。另外，通过测定H2O2含量可知，Se处理幼苗根尖H2O2含量比CK涨幅达到1.4倍，Se+CA50处理则使H2O2含量比Se处理显著降低15.4%；同样地，CA50处理的H2O2含量显著低于Se和Se+CA50处理(图 5，C)。可见，肉桂醛能够显著减少硒胁迫导致的不结球白菜幼苗体内H2O2累积。

2.6 肉桂醛对硒胁迫下不结球白菜幼苗PAO活性的影响

从图6来看，以Spd、Spm为催化底物时，Se处理可以诱导不结球白菜幼苗根内PAO活性分别比相应CK显著上升73.8%和16.9%；Se+CA50处理使根内PAO活性比Se处理分别显著降低38.5%和21.3%，并与相应CK差异不显著；CA50处理根内PAO活性与Se+CA50处理相比均无显著差异(图6)。另外，Se处理以Spd为催化底物的PAO活性均明显高于相应的以Spm为催化底物的PAO活性。这表明硒胁迫可能主要通过诱导 PAO代谢Spd产生H2O2，肉桂醛则逆转这一途径。

2.7 肉桂醛对硒胁迫下不结球白菜幼苗6个BrPAOs家族基因表达量的影响

我们前期从不结球白菜基因组中鉴定出6个BrPAOs家族基因(BrPAO1-6)[12]。从图7，C、E、F可知， Se处理可以显著诱导不结球白菜幼苗BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表达水平上调，分别比CK显著提高68.2%、57.7%和53.9%；而硒胁迫下加入CA50(Se+CA50处理)使BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表达水平下调，分别比Se处理显著降低21.1%、61.3%和30.2%。同时，在Se处理下，不结球白菜幼苗BrPAO1和BrPAO4表达水平与CK差异不显著，而BrPAO2表达水平却比CK显著下降11.6%；与Se处理相比，Se+CA50处理幼苗BrPAO1表达水平显著降低，BrPAO4表达水平无显著变化，BrPAO2表达水平却显著升高(图 7，A、B、D)。以上结果表明，不结球白菜幼苗BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表达水平在Se处理和Se+CA50处理下分别显著上调和下调，可能是导致最终PAO活性上升和下降的原因之一。

2.8 肉桂醛-硒处理后不结球白菜幼苗生理指标相关性分析

聚类热图常用于分析和可视化大规模数据[22-23]。将不同处理下测定的所有生理参数指标与各自对照相除并进行log2归一化后，进行聚类分析。聚类结果(图 8，A)显示：不结球白菜幼苗根长和鲜重在Se处理后蓝色加深，它们相比对照显著下降；而在Se+CA50处理后蓝色变浅，说明加入肉桂醛缓解了这两个参数的下降趋势。而不结球白菜幼苗其他伤害性参数指标(H2O2、MDA含量、细胞死亡、PAO、BrPAOs)则呈现相反的变化趋势。这些结果说明肉桂醛能够显著逆转Se胁迫对植物造成的生理效应。

同时，为了进一步总结肉桂醛的调控模式，将所有生理参数指标在不同处理方式下(CK、Se、Se+CA50)进行 Pearson 相关性分析，Pearson相关系数值介于-1和+1之间[24]。结果(图 8，B)显示：不结球白菜幼苗生长指标根长与鲜重呈正相关，它们分别与其他生理指标呈负相关。H2O2、MDA含量和细胞死亡呈正相关，H2O2、MDA 含量和细胞死亡分别与生长指标(根长、鲜重)呈负相关，说明 H2O2导致MDA含量累积，造成细胞死亡，进而影响生长；PAO(Spd)、PAO(Spm)活性以及BrPAO3、BrPAO5、BrPAO6表达量均与H2O2含量呈正相关，BrPAO3、BrPAO5、BrPAO6表达量与PAO(Spd)活性的相关性高于与PAO(Spm)活性的相关性，PAO(Spd)活性与H2O2含量的相关性高于PAO(Spm)活性，说明BrPAO3、BrPAO5、BrPAO6激活PAO(Spd)效率高于PAO(Spm)，进而影响H2O2累积。BrPAO调控H2O2生成的效率顺序为：BrPAO3>BrPAO6>BrPAO5。这些相关性分析结果进一步证明：肉桂醛通过抑制PAO- H2O2信号模块，进而减少H2O2累积和细胞死亡，从而缓解硒胁迫对植物生长的抑制效应。

3 讨 论

高剂量的硒会导致植物中毒，进而造成植物生长受阻[25]。前人研究发现，烟草生长在土壤硒含量≤1.00 mg· kg-1时得到促进，而在土壤硒含量≥1.75 mg· kg-1则受到抑制[26]；当Na2SeO3超过20 μmol·L-1时，黄瓜植株表现出生物量下降及脂质过氧化水平增加[27]；高浓度硒 (≥10 mg· kg-1) 还能抑制人参菜株高、茎粗、根长的增加，从而导致人参菜生物量的降低[28]。本研究发现，硒胁迫可显著抑制不结球白菜幼苗的根生长，其根长和根鲜重在Na2SeO3超过20 μmol·L-1时显著下降。

ROS过量累积进而导致脂质过氧化和细胞死亡，是植物产生硒毒害的重要原因[29]。本研究发现硒胁迫对不结球白菜幼苗根细胞造成了严重的氧化损伤和细胞死亡效应；而肉桂醛作为一种具有抗氧化活性的天然化合物，其能够激活不结球白菜幼苗植株对硒胁迫的耐性；聚类和相关性分析表明，肉桂醛可通过抑制ROS过量累积，进而显著缓解上述硒胁迫诱导的损伤效应。

在逆境胁迫下，PAO代谢多胺产生H2O2是植物体内ROS产生的一个重要途径[10]。高温胁迫导致水稻植株PAO活性显著上升[30]；缺氧胁迫导致甜瓜生长受到抑制，并伴随着PAO活性和H2O2含量显著增加[31]。本研究结果显示，硒胁迫导致了不结球白菜根内PAO活性和H2O2水平的显著上升，而加入肉桂醛则显著降低了PAO活性和H2O2水平。这说明在硒胁迫条件下，肉桂醛可以通过抑制PAO活性减少ROS在不结球白菜根内的产生和累积。

硒胁迫可导致不结球白菜BrPAOs基因转录水平显著上调。本实验室前期研究发现BrPAOs分为3个亚家族[12]。BrPAO1属于亚家族Ⅰ，参与多胺的末端分解代谢，推测Spd和Spm都可能是其催化底物；BrPAO2-6属于亚家族Ⅱ，可能参与多胺的反向转化(Spm→Spd或者Spd→Put)途径，具有催化底物多样性。本研究发现硒胁迫显著诱导不结球白菜根内BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表达水平上调，而且硒胁迫下诱导的PAO活性在以Spd为催化底物时相对更高。这说明不结球白菜在响应硒胁迫的过程中，BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6可能更倾向于以Spd为底物的多胺逆向转化。加入肉桂醛后可抑制上述3个BrPAO基因的表达，又说明肉桂醛可在转录水平发挥作用调控植物体内PAO活性。后续研究将结合生物化学方法进一步鉴定不同BrPAO的催化功能，将有助于深度揭示肉桂醛参与调控植物体内多胺代谢对逆境的响应方式。

肉桂醛具有抗氧化作用，可以有效降低动物细胞中ROS累积。肉桂醛通过激活酶促和非酶促抗氧化途径有效降低关节炎大鼠ROS累积[32]。肉桂醛预处理增加了 SOD 活性并降低了心肌中的氧化损伤水平，对心脏起到保护作用[33]。这表明肉桂醛针对动物细胞的抗氧化特性体现为清除过量产生的ROS。而本研究结果表明，肉桂醛通过调控不结球白菜PAO-H2O2系统直接抑制ROS的过量生成来缓解硒胁迫。这说明肉桂醛针对真核细胞的抗氧化作用主要表现为两方面：一是清除已经过量产生的ROS，二是阻断部分ROS的过量产生。深入研究比较肉桂醛在动物和植物细胞中不同的作用方式，将有助于进一步解析肉桂醛抗氧化特性的作用机制。本研究初步发现了肉桂醛调控植物耐受硒胁迫的生物特性和作用方式，即肉桂醛抑制PAO-H2O2系统缓解硒胁迫，为进一步深度解析植物源天然化合物肉桂醛缓解植物硒毒害的信号调控网络提供了工作基础，并为农业生态环境中硒肥的合理施用调控提供了理论依据。