淫羊藿黄酮对大鼠血清内源睾酮水平的影响

宋彦显，闵玉涛，彭 聪，马庆一

(1．郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044；2．郑州市速冻面米食品质量与安全重点实验室，河南 郑州450044；3．郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002)

淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)为小檗科淫羊藿属植物，又称仙灵脾、放杖草等，是国家卫生部批准的可用于保健食品的中草药之一。黄酮是淫羊藿的主要功能成分之一[1-4]，近年来研究发现，淫羊藿黄酮具有抗疲劳、补肾壮阳、祛风湿、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、抑制酪氨酸酶活性、抗炎抑菌、减少动脉硬化风险、防治骨质疏松等生物活性[5-7]。淫羊藿及其黄酮在抗疲劳方面的研究方兴未艾，但对其作用机制的研究尚不多见[8-9]。

已有文献报道剧烈运动可导致血清睾酮水平降低，从而导致机体疲劳[10-11]。提高睾酮浓度或抵抗睾酮浓度下降已成为诸多物质抗疲劳活性的作用机理之一，据此机理开发抗疲劳功能食品已成为研究的热点[12-13]。本文以淫羊藿为原料，经提取纯化，制备淫羊藿黄酮，考察淫羊藿黄酮对大鼠血清内源睾酮水平的影响，探究淫羊藿抗疲劳作用机理，为淫羊藿保健食品和药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淫羊藿：购于郑州中药城,经河南省中医药大学杨怀霞老师鉴定为小檗科(BerbeHdaceae)淫羊藿属(EpimediumL．)植物；SD大白鼠：SPF级，雄性，体重300～320g，购于河南省实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(豫)2017-0001；大鼠睾酮(T)酶联免疫试剂盒：96T，天津九鼎医学生物工程有限公司，批号20110402；芦丁：色谱纯，中国药品生物制品鉴定所；AB-8大孔吸附树脂：BR级，上海源叶科技生物有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

723可见分光光度计：上海第三分析仪器厂；HH-S11-2电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；ZFQ85A旋转蒸发器：上海医械专机厂；TG328A电光分析天平：上海天平仪器厂；2XZ-0.5旋片式真空泵：浙江黄岩真空泵厂；ZF-C三用紫外灯：上海康禾光电仪器有限公司；FFC-15粉碎机：山东即墨农业机械厂；XK96-B快速混匀器：泰州姜堰新康医疗器械有限公司；4MK2自动清洗机：Thermo公司；Multiskan FC酶标仪：赛默飞世尔公司。

1.3 试验方法

1.3.1 淫羊藿黄酮的提取与纯化

取15g粉碎至40目的淫羊藿置于500mL圆底烧瓶中，加水300mL，回流提取1h，趁热抽滤，提取3次，合并3次滤液，加乙醇至体积分数为70%，离心除去沉淀，旋转蒸发除去乙醇。

AB-8大孔树脂经预处理后，取水提醇沉后的黄酮浓缩液进行纯化。上样量为30mL，先用2倍柱体积的蒸馏水洗脱，随后再以70%乙醇洗脱，洗脱速度为2 mL/min。采用三氯化铁跟踪检测，合并所有正反应的洗脱液，浓缩、定容并测定黄酮含量。

1.3.2 淫羊藿黄酮的定性分析

根据文献[14]对淫羊藿黄酮进行定性分析。

1.3.3 淫羊藿总黄酮含量的测定

精确称取芦丁标准品溶解，稀释成0.2mg/mL的芦丁标准溶液。准确移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL芦丁标准溶液分别置于25mL容量瓶中，用30% 乙醇稀释至12.5mL，加入5%NaNO2溶液0.5mL,静置6min 后加入0.5mL 10%Al(NO3)3溶液，静置6min，再加入4.0mL 4%NaOH溶液，30%乙醇溶液定容至25mL。碱性条件下显色12 min，以不加芦丁标准溶液为空白，510nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。

准确移取淫羊藿黄酮样品溶液2.0 mL置于25mL容量瓶中， 按上述操作以不加样品为空白，根据标准曲线和回归方程，计算黄酮含量。

1.3.4 酶联免疫分析法测定大鼠血清睾酮含量

将标准品稀释至20pmol/mL，以倍比稀释液(0.5，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156 pmol/mL) 做对照(用前15min配制)。将不同浓度的标准溶液100μL加样至酶标板中，轻轻混匀，加盖，37℃反应2h，洗涤液洗板5次，各加底物溶液90μL，37℃避光显色30min，加终止液50μL终止反应。用酶标仪在630nm波长处依次测定各孔的光密度(OD值)，以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。

将50只SD雄性大白鼠分成10组，每组5只，按表1将黄酮水作为必需的饮用水进行饲养(第1组为对照组)，各组全部供给同样食物。15天后，尾部取血，30min内离心(3000r/min，15min)，取血清测定睾酮含量。

表1 淫羊藿黄酮水的浓度

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

510nm处绘制的芦丁标准曲线如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

芦丁是黄酮测定常用的标准品，由图1可知，芦丁浓度越高，在510nm处的吸光度值越大，两者呈较好的线性关系，回归方程为：y=0.3132x，R2=0.9995，可用于淫羊藿黄酮浓度的测定。

2.2 淫羊藿黄酮的提取

510nm处分别测定各次水提、醇沉、纯化后样品的吸光度值，每个样品作3个平行对照，根据芦丁浓度和平均吸光度值回归方程计算浓度，计算含量和得率，结果如表2所示。

表2 淫羊藿黄酮提取纯化各阶段含量和浓度

总黄酮的提取方法主要有超声波辅助提取法、超高压提取法、索氏提取法、水煎煮法等[15-16]。超声波辅助提取法和超高压提取法提取率高，但需要专业设备，成本高，不适于工业化生产；索氏提取法不能用于大规模生产；与乙醇回流法相比，水溶法的提取率略高，但杂质偏多；将水溶法与醇沉结合起来既可以提高提取率，又可以除去杂质，其成本相对较低，适合于工业化生产。因此，本文采用水溶法提取淫羊藿总黄酮。由表2 可知，第3次水提后的黄酮含量已较低，综合考虑回收的黄酮数量与耗费的时间、人力和能量，在工业化生产中采用两次水煎法提取黄酮即可。

醇沉后的黄酮含量略有下降，可能是在测定的波长范围内有吸收的干扰杂质被除去的缘故。另外，少量黄酮与杂质之间可能存在的共沉淀也是不可忽视的因素。本文水煎煮法的提取率为5.65%，醇沉后得率为4.57%，较为理想。

2.3 AB-8大孔吸附树脂纯化淫羊藿黄酮

由表2可知，纯化后的淫羊藿黄酮浓度为 8.507mg/mL，相比纯化前浓度提高5.1倍，纯化得率为77.52%。在纯化过程中，大孔吸附树脂吸收了干扰杂质，使黄酮的纯度升高，含量略有下降。树脂使用3次后，总黄酮吸附量下降约41.23%，需要重生后使用。AB-8大孔吸附树脂纯化黄酮得率高，效果好，可以作为黄酮纯化的选择之一。

2.4 淫羊藿黄酮的定性分析

采用盐酸-镁粉法、三氯化铁反应、薄层层析法对淫羊藿不同提取阶段的产物进行显色反应检测，结果如表3所示。

表3 淫羊藿不同提取阶段产物显色反应结果

在盐酸-镁粉实验中，一些黄酮类化合物,如黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类，在镁粉-盐酸作用下，易被氢化还原，迅速生成紫红色(个别蓝色)，试管中出现大量的气泡，同时呈现红色-紫红色。三氯化铁为常用的酚类显色剂，多数黄酮类化合物因分子中含有酚羟基，可产生正反应，呈现绿、蓝、黑、紫等颜色。在洗脱400mL左右时，开始呈现绿色，大约600mL时呈现黑色，之后呈绿色。收集400～500mL时，三氯化铁已不再显色。薄层层析板在紫外灯下，出现1个主点，2个辅点。用三氯化铝显色后，主点为橙红色荧光点。以上检测结果均证明了淫羊藿中黄酮的存在。

2.5 大鼠睾酮基准物的标准曲线

用酶标仪于波长630nm处测定各稀释鼠睾酮标准品吸光度(OD值)，以鼠睾酮标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 大鼠睾酮基准物的标准曲线

由图2可知，大鼠睾酮基准物浓度和630nm处吸光度值呈较好的线性关系，标准曲线回归方程：y=23.409x，吸光度和浓度呈很好的线性关系，R2=0.9843，可以作为大鼠睾酮测定的依据。

2.6 双抗体夹心酶联免疫法测定大鼠血清睾酮含量

大鼠尾部取血，测定630nm处吸光度值，根据大鼠睾酮基准物的标准曲线和回归方程，计算大鼠血清睾酮含量，以平均值和对照组的差值作图，如图3所示。

图3 大鼠血清中的睾酮含量变化

由图3所示，饮用淫羊藿黄酮水后大鼠的睾酮水平都有不同程度的提高，随着淫羊藿水溶性黄酮量的提高，大鼠的睾酮水平不断提高，相比对照组最多提高了8.934 pmol/mL。结果表明，淫羊藿黄酮能促进大鼠的血睾酮分泌，提高大鼠的血睾酮浓度，是淫羊藿黄酮抗疲劳的机理之一。

3 结论

采用水提结合醇沉法提取淫羊藿黄酮，提取率较高，成本低，可应用于功能性饮料工业化生产中。大孔树脂AB-8纯化淫羊藿黄酮效率高，是一种黄酮纯化的有效方法。淫羊藿黄酮作为淫羊藿抗疲劳活性成分之一，促进大鼠的血睾酮分泌，提高大鼠的血睾酮浓度，是其作用机理之一，可开发淫羊藿抗疲劳运动饮料等抗疲劳产品。淫羊藿黄酮化合物种类较多，需进一步分离纯化各成分并进行抗疲劳活性研究，鉴定活性成分结构，研究其构效关系。