环丙沙星酶联免疫分析方法的建立

陆 宁， 蒲顺昌， 邢 爽， 孙玉喜， 丁德杰， 屈业锋， 张志祥， 张慧敏*

(1.亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800； 2.药食同源功能食品亳州市重点实验室，安徽 亳州 236800)

环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)又称环丙氟哌酸,是第三代氟喹诺酮类药物[1-2]。环丙沙星具有广谱抗菌活性,杀菌效果好,曾普遍应用于水产动物的疾病治疗[3-4]。然而人类长期食用有环丙沙星残留的水产品会对健康造成损害,引发食源性疾病,出现胸闷、呼吸困难等心血管系统反应症状,有的会出现结晶尿甚至血尿,对肾脏有一定的损害,还会诱发精神失常、癫痫等中枢神经系统不良反应,其中变态反应发生率最高,主要表现为过敏性哮喘、休克等[5-6]。

目前,环丙沙星已被欧盟、中国等列为水产养殖禁用药物[7-8]。水产品中环丙沙星的检测越来越引起人们的重视。

环丙沙星的检测方法目前主要有微生物法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等,这些方法不仅操作繁琐、仪器价格昂贵,而且不适合大规模的现场检测[9-12]。以免疫学方法为基础的快速检测方法,具有快速、灵敏、价格低廉、适合大规模检测等优点,是目前公认最适合作为药物残留检测的快速筛选方法之一[13-14]。

本实验将CIP与牛血清蛋白(BSA)偶联制备免疫原,免疫新西兰大白兔,制备高特异性的CIP抗体,对抗原抗体结合性能进行优化,开发出一种高灵敏度的环丙沙星特异性快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氧氟沙星标准品，环丙沙星标准品，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N,N-二甲基酰胺(DMF)，牛血清蛋白(BSA)，鸡卵血清蛋白(OVA)，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂(美国Sigma公司),正辛酸，硫酸铵，氢氧化钠(广州台山粤桥化工厂);脱脂奶粉(食用级安怡公司);酶标二抗(美国Bioworld公司)；TMB显色液，吐温-20(北京索莱宝科技有限公司)；鱼肉、鸡蛋(当地超市)。

1.2 仪器与设备

ME204电子天平(美国Mettler toledo公司);ND1000紫外分光光度计(美国Thermo公司);QL-861振荡器(海门市其林贝尔仪器有限公司);6K15冷冻离心机(美国Sartorius-Sigma公司);M2E多功能酶标仪(美国Molecular device公司);DHG-9145电热鼓风干燥箱(上海恒一科技有限公司);DK-8D电热恒温水槽(上海医用恒温设备厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 人工抗原的制备与鉴定 利用活泼酯法,将2 mg环丙沙星标准品与2 mg NHS和2 mg EDC共同溶解于500 μL DMF中,4 ℃下避光搅拌过夜。取5 mg的BSA溶解于1 mL 0.1 mol/L pH 9.6碳酸盐溶液中,将250 μL环丙沙星半抗原活化液缓慢向BSA的反应溶液中滴加,室温下搅拌3 h。用同样的方法制备CIP-OVA、OFL-OVA。将所得到的反应溶液在4 ℃下,用磷酸盐缓冲溶液透析3 d(每12 h换1次透析液),得到目标产物CIP-BSA、CIP-OVA、OFL-OVA,于-20 ℃分装保存[15]。偶联产物通过紫外吸收光谱来鉴定半抗原与载体蛋白是否偶联成功。

1.3.2 动物免疫 选用健康雌性新西兰大白兔进行免疫。取250 μL 1 mg/mL的免疫原CIP-BSA与等量弗氏完全佐剂混合进行乳化。采用皮下多点注射的方式进行免疫,每只免疫350 μL剂量。免疫周期间隔3周,自第2次免疫开始,均取免疫原与等量的弗氏不完全佐剂混合乳化。共进行4次免疫后,间隔1周采血清,混入等量甘油,于-20 ℃保存。

1.3.3 多克隆抗体的纯化 取兔血清在4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min,将上清液与醋酸盐缓冲液按1∶2比例混合,pH调至4.8。向混合液中逐滴加入少量正辛酸,室温下搅拌30 min,于4 ℃下静置2 h。4 ℃下12 000 r/min离心15 min,用125 μm尼龙网过滤上清溶液。向反应溶液中加入磷酸盐缓冲液,pH调至7.4。冰浴条件下,于30 min内向反应溶液中加入0.28 g/mL的硫酸铵,静置1 h以上。4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min,弃上清液,沉淀用磷酸盐缓冲液透析3 d,得到的纯化抗体在-20 ℃条件下保存。

1.3.4 间接竞争ELISA检测多克隆抗体性能 将异源包被原氧氟沙星-OVA与同源包被原环丙沙星-OVA分别用包被液(碳酸盐缓冲液)稀释至1 μg/mL后,向96孔酶标板中每孔加入100 μL,37 ℃水浴过夜,用5%脱脂奶粉封闭后制板成功。利用制备好的酶标板,采用间接竞争ELISA法比较同源、异源包被条件下的检测结果,筛选出效价更好、识别环丙沙星灵敏度更高的包被原及多克隆抗体。

1.3.5 包被原浓度及抗体稀释倍数的确定 将包被原(环丙沙星-OVA)用包被液按1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000倍稀释,抗体用磷酸盐缓冲液按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000进行稀释。用10 ng/mL的环丙沙星标准品做抑制对比,进行ELISA反应,计算每个包被原浓度与抗体稀释倍数组合的抑制率,确定最适宜的包被浓度和抗体稀释倍数。

1.3.6 标准曲线的建立 选择包被原浓度和抗体稀释倍数最适宜的3个组合,用磷酸盐缓冲液将环丙沙星标准品稀释至0、0.001 9、0.015、0.122、0.977、7.81、62.6、500 ng/mL,每孔分别加入50 μL抗体和50 μL环丙沙星标准品,进行EILSA实验。利用Origin 8.5拟合标准曲线,并计算半抑制浓度IC50。

1.3.7 交叉实验 将环丙沙星结构类似物:马波沙星、莫西沙星、吡哌酸、萘啶酸、如氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、普卢利沙星与环丙沙星标准品在相同条件下分别进行ELISA测定,计算其标准曲线的半抑制浓度,以环丙沙星为基准(100%),考察交叉反应的情况。

CR=IC50(环丙沙星)/IC50(其余结构)×100%

1.3.8 回收试验 将1 g鱼肉组织切碎,放入离心管,加入2 mL三氯乙酸(7.5% TCA)混匀,4 ℃下5 000 r/min离心10 min,用磷酸盐缓冲液稀释50倍得到鱼肉样品。称取1 g鸡蛋样品置于离心管中,加5 mL三氯乙酸(7.5% TCA)混匀,4 ℃下5 000 r/min离心10 min,用磷酸盐缓冲液稀释20倍得到鸡蛋样品。向鱼肉样品中添加1、0.5、0.2、0.1 ng/mL的环丙沙星标准品,向鸡蛋样品中添加2、1、0.5 ng/mL的环丙沙星标准品,按照ELISA步骤测定,每个样品设4个重复,计算添加回收率。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的制备与鉴定

CIP、BSA、CIP-BSA的紫外扫描结果如图1所示,CIP在208和256 nm有吸收特征峰,BSA在280 nm有吸收特征峰,CIP与载体蛋白发生偶联反应后,CIP-BSA特征峰向左发生偏移,相对于CIP和载体蛋白有明显改变,表明载体蛋白与CIP偶联成功。CIP、OVA、CIP-OVA的紫外扫描结果如图2所示,CIP与载体蛋白OVA偶联反应后,CIP-OVA特征峰发生偏移,表明载体蛋白OVA与CIP偶联成功。OFL、OVA、OFL-OVA的紫外扫描结果如图3所示,OFL与OVA偶联反应后,OFL-OVA特征峰发生偏移,相对于OFL和OVA有明显改变,表明OVA与OFL偶联成功。

图1 CIP、BSA和CIP-BSA的紫外光谱Fig.2 UV spectrum of CIP, BSA and CIP-BSA图2 CIP、OVA和CIP-OVA的紫外光谱Fig.2 UV spectrum of CIP, OVA and CIP-OVA图3 OFL、OVA和OFL-OVA的紫外光谱Fig.3 UV spectrum of OFL, OVA and OFL-OVA

2.2 多克隆抗体性能测定

如图4～5所示,1、2号兔多克隆抗体异源包被检测、同源包被检测的效价抑制曲线。其中粉色线代表异源包被检测曲线,黑色线代表同源包被检测曲线。1、2号兔多克隆抗体,同源包被检测的抑制率均高于异源包被检测,而2号兔多克隆抗体的异源包被检测抑制率又比1号兔多克隆抗体高。故选用同源包被检测以及2号兔多克隆抗体进行方法建立实验。

图4 1号兔多克隆抗体对CIP的效价抑制曲线

图5 2号兔多克隆抗体对CIP的效价抑制曲线

2.3 适宜包被浓度及抗体稀释倍数的确定

棋盘滴定实验结果如表1所示,选用吸光值A450 nm在1.0～1.5之间的包被原浓度及抗体稀释倍数组合[16]。选用对CIP抑制率较高的(2 000、4 000)(4 000、4 000)(8 000、4 000)3个组合,建立CIP抑制标准曲线。

表1 不同包被浓度及抗体稀释倍数条件下对环丙沙星的抑制率

2.4 标准曲线的建立

3个不同条件下抗体对环丙沙星的检测性能如图6和表2所示。当包被原稀释8 000倍,抗体稀释倍数为4 000倍时,对CIP检测灵敏度最高,IC50为0.16 ng/mL,检测限LOD为0.012 ng/mL。故选用(8 000、4 000)组合。

图6 不同包被浓度条件下对环丙沙星检测的ELISA标准曲线图

表2 标准曲线参数对比

2.5 交叉实验

实验结果如表3所示,除诺氟沙星外,其他结构类似物的交叉反应率均在15%以下,表明抗体可用于环丙沙星和诺氟沙星的特异性检测。

表3 抗体与9种氟喹诺酮类药物的交叉反应

续表3

2.6 添加回收试验

实验结果如表4所示,该方法对鱼肉及鸡蛋样品中环丙沙星的添加回收率在80%～110%之间,整体回收率在合理范围内,可用于实际样品中环丙沙星残留的检测。

表4 环丙沙星添加回收试验结果

3 结论与讨论

本研究采用活泼酯法制备免疫原环丙沙星-BSA、同源包被原环丙沙星-OVA和异源包被原氧氟沙星-OVA,通过紫外扫描判断偶联成功,利用免疫原免疫动物,纯化后得到多克隆抗体。

用ELISA法检测抗体,发现同源包被抗原比异源效果好,推测是因为氧氟沙星的哌嗪基上连有碳链,在与抗血清结合的过程中氧氟沙星哌嗪基碳链会影响分子整体的电荷分布情况,使得抗原抗体结合部位的环外氧电荷密度降低,从而降低了与抗体的结合能力。

对ELISA反应体系进行优化,在最优条件下,该检测方法对环丙沙星的检测灵敏度IC50为0.160 ng/mL,检测限为0.012 ng/mL,远低于WHO的限量标准1 ng/mL,是一种极为灵敏的环丙沙星快速检测方法。

该抗体与大部分环丙沙星结构类似物的交叉反应率(CR)在15%以下,具有较强的特异性。其中,诺氟沙星的CR大于100%,可能是因为与N连接的碳链比三元环更容易吸引正电荷,从而使结合部位环外氧电荷密度高,结合更加紧密。其他结构的CR均低于15%,推测恩诺沙星的哌嗪基上有碳链,使得分子整体的电荷分布远离结合部位,环外氧电荷密度低,结合不紧密;普卢利沙星有N、S杂环和含O杂环,降低了结合部位的环外氧电荷密度;如氟沙星中S的得电子能力比环丙沙星的O强;莫西沙星两个含N杂环对电子的吸引力更高;萘啶酸分子量较小,没有标志性刚性结构;吡哌酸和马波沙星二氮杂环比苯环吸电子能力强;上述原因导致这些结构的CR较低。

在实际样品检测中,合理的添加回收率表明,该检测方法能够满足日常检测要求,可用于环丙沙星的快速检测。结合交叉反应实验得出,本研究建立了一种能够特异性识别环丙沙星和诺氟沙星的高灵敏度检测方法。