种子不同贮藏温度对玉米幼苗生长及相关代谢基因表达的影响

姚文豪， 陈志英， 王 杰， 徐 魏， 李文阳

(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)

玉米是世界上重要的粮食作物之一,也是我国三大主要粮食作物之一,对保证国家粮食安全有着重要的作用[1-2]。与此同时,我国对于玉米的需求量不断增长，消费量从2010/2011年度的1.92亿t增长至2019/2020年度的2.96亿t,增长54%,年均增长5.1%。我国对玉米种子的需求量不断增加,贮藏问题显得额外重要[3-4]。种子从收获后即开始发生劣变和老化,老化种子表现为发芽力和活力下降，细胞膜损伤，生理特性改变，遗传完整性变差,最终失去生命力和种用价值[5-6]。高活力的种子对玉米质量与产量有着很大的影响[7]。确保玉米种子贮藏后的活力至关重要，温度是决定玉米贮藏活力大小的一个关键外部因素,脂质过氧化被公认是导致种子陈化变质的最主要因素,而脂肪氧化酶是脂质降解的关键酶[8],SOD、POD和CAT是植物体内的抗氧化酶系统[9],低温贮藏下的SOD、POD和CAT活性高于常温贮藏下的酶活性,与室温贮藏相比低温贮藏有利于维持种子活力[10]。除此之外,品种本身的生理特性也是影响种子活力的另一重要因素[11-12]。常温条件下,玉米种子种胚大,呼吸旺盛,同时胚部脂肪含量高,容易酸败,与常温贮藏相比,低温贮藏下种子代谢弱,消耗贮藏物质少,有利于贮藏物质的积累,有利于种子活力的保持[10,13]。

因此,分析玉米种子在低温贮藏环境中的内在变化与常温环境中的区别,对探究玉米种子低温贮藏的内在机理变化,提高贮藏种子的活力有着重要的意义。随着转录组测序技术在农业科学上的不断发展[14]，可以对玉米的转录组序列结构进行解释和功能分析,从而揭示玉米植株内部的生物抗性[15]。本试验通过计算常温和低温贮藏下玉米种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数来比较两种不同贮藏温度下种子活力大小,并通过选择常温和低温贮藏下的玉米种子为材料，利用RNA-sep转录组测序方法,筛选出差异基因,通过KOG注释、GO分类、KEGG注释分析,从分子水平上为玉米低温和常温贮藏时内部机理变化所产生的差异提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

以蠡玉166为供试材料。将种子于2020年6-8月分别放置于室温贮藏(对照,Control)和低温(0～4 ℃)贮藏(Low temperature condition)。将不同温度贮藏条件下种子进行标准发芽试验,人工气候箱中25 ℃,RH95%,其中12 h光照，12 h黑暗。3次重复,每重复50粒,湿沙床在消毒后进行标准发芽实验,3 d后计算发芽势,7 d后计算出发芽率并进一步计算出发芽指数和活力指数。

发芽势=(第3天种子发芽数/试验种子总数)×100%;

发芽率=(第7天种子发芽数/试验种子总数)×100%;

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt);

活力指数(VI)=GI×S;

式中,Gt为t时间种子发芽数,Dt为相应发芽时间;S为第7天幼苗长度。

取7 d后的幼苗,用液氮将冷冻管中实验材料急速冷冻,保存于-80 ℃下。试验样品委托上海生工生物工程公司进行检测。

1.2 测定项目及方法

使用FastQC 0.11.2软件对各个样本测序的原始数据进行质量评估;使用StringTie-1.3.3b软件对每个样本进行组装;使用DEGseq 1.26.0软件进行组间差异表达分析[16]。设置参数:qValue<0.05,且差异倍数|FoldChange|>2。采用topGO 2.24.0进行GO富集分析。使用ClusterProfiler 3.0.5进行KEGG通路和KOG分类富集分析。基于基因功能富集分析结果。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度对玉米种子活力的影响

由表1可知,低温贮藏种子在发芽势、发芽率、活力指数分别高出常温种子8%、12%、56.60%,说明低温条件更有利于种子活力的保持。

表1 不同贮藏条件下玉米种子活力的变化

2.2 测序数据质量分析

由表2可以看出,2处理各重复样品测序Q20 Bases Ratio>98%,碱基百分比Q30 Bases Ratio>94%,52.74%≤GC Bases Ratio≤56.25%,证明数据可行性高,可作为后续的分析依据。

表2 样本QC数据统计

2.3 差异表达基因的筛选

为了检测基因表达在贮藏条件下对玉米种子发芽率降低后幼苗的影响,设置参数:qValue<0.05,且差异倍数|FoldChange|>2,作为显著差异的表达基因。低温贮藏的玉米种子与自然贮藏状态下的玉米种子处理间筛选出差异基因4个,其中,上调基因3个,下调基因1个(图1)。

图1 不同贮藏方式差异表达基因比较

2.4 差异表达基因的KOG注释

由图2可知,低温贮藏的种子与自然贮藏状态下的种子处理在KOG注释分析中,有19 656个KOG功能得到注释,无富集化表达功能,低温与常温对照无明显差异。

图2 差异表达基因KOG功能分类图

2.5 差异表达基因的GO分类

如图3所示，在GO分析中低温贮藏的种子与自然贮藏状态下的种子处理之间,在生物过程中应激反应、代谢过程、细胞过程3个亚类存在差异,差异基因各1个;细胞过程中细胞、细胞部分、细胞器3个亚类存在差异,差异基因各1个;分子功能中结合成分存在差异,差异基因1个。

图3 差异基因GO注释分类柱状图

2.6 差异表达基因KEGG注释分析

如图4显示,在KEGG注释分析中有机系统的环境适应组分存在显著差异,包含差异基因4个;其它组分均未发现显著差异。低温贮藏的LY166种子与自然贮藏状态下的LY166种子处理的KEGG的通路分析表明植物病原菌互作P<0.01达到极显著水平,表明贮藏条件影响植物病原菌互作过程,降低相关基因表达量,最终不利于种子萌发后幼苗的生长(表3)。

图4 差异基因KEGG注释分类柱状图

表3 不同贮藏条件下玉米种子差异基因KEGG通路分析

3 结论与讨论

与常温对照相比低温贮藏更有利于维持种子活力。发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数等指标一直作为众多研究者探讨种子活力和寿命的重要指标[17-18]。转录组测序技术的应用很大程度上推动了植物分子水平方面的研究[19]。RNA-Sep是一种在转录水平上更为精确的测定分析方法，其通量高、分辨率高、灵敏度高且不受物种限制[20]。本研究对自然贮藏和低温贮藏玉米种子,萌发幼苗进行芽势、发芽率、发芽指数、活力指数的计算比较以及RNA-Sep测序分析。

试验研究结果表明,低温贮藏下的玉米种子在发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数上显著高于常温对照种子,发芽势、发芽率、活力指数分别高出8%、12%、56.60%。低温贮藏有利于保持玉米种子中SOD、POD和CAT酶的活性,有利于抑制细胞内所发生的脂质过氧化作用和清除过量累计自由基,维持种子活力[10,21-22]。RNA-Sep测序分析结果表明,玉米转录组共获得4个差异基因,3个上调基因,1个下调基因。在KEGG代谢途径分析中,植物-病原互作相关代谢途径表达明显上调。王艺璇等[23]在番茄低温响应WRKY转录因子的鉴定和分析中指出低温胁迫能够诱导水杨酸(SA)活性氧(ROS)和茉莉酸(JA)的产生。Kasote等[24]在西瓜枯萎病敏感和抗性植株在植物与病原菌互作中激素和代谢产物的反应中研究表明,植株在接种尖孢镰刀菌(FON)后第8天,植株中水杨酸(SA)水平显著高于对照植株。说明在低温贮藏下有利于植株体内有机酸的生成,提高植株与病原菌的互作能力。

嘌呤代谢途径明显下调。Fujihara等[25]发现植物衰老和种子发芽常有大量尿酸的积累。表明低温贮藏条件下的种子尿酸等物质的基因表达受到抑制,可以减缓种子衰老,抑制发芽,进一步从分子水平上为玉米种子低温贮藏和常温贮藏时内部机理变化所产生的差异提供参考。