参松养心胶囊微生物限度检查方法研究

武 玲 曹鲁娜 任颖慧 赵蕊蕊

参松养心胶囊收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部，由人参、麦冬、山茱萸、桑寄生、土鳖虫、赤芍、黄连等中药经现代制药工艺制成，具有益气养阴，活血通络，清心安神之功效[1]。有研究按照《中华人民共和国药典》2005年版和2010年版要求开展参松养心胶囊的方法验证，发现该样品有明显抑菌活性[2-3]。自《中华人民共和国药典》2015年版起微生物计数方法在培养体系、检测方法等方面做了较大修订[4]，本研究按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则1105、1106和1107要求，通过检索文献[5-7]，结合微生物限度标准和企业提 供的资料，选定敏感菌株，采用3批样品开展独立平行试验，从平皿法最低稀释级开始进行预试验，采用增加稀释倍数、使用中和剂等设计方法适用性试验。现报道如下。

1 仪器及试药

1.1 仪器设备

BSC-1300ⅡA2生物安全柜；JE1201电子天平；DNP-9162BS-Ⅱ电热恒温培养箱；BPH-9272精密恒温培养箱；MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器等。

1.2 供试品

参松养心胶囊，北京以岭药业有限公司，批号2101017、2102023、2104009。

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]，白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001]，枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，CMCC（B）63501]，大肠埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B）44102]，铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104]，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]，乙型副伤寒沙门菌[Salmonella paratyphi B，CMCC（B）50094]，均来源于广东环凯微生物科技有限公司，经本实验室复苏传代并鉴定合格，本试验所用菌种均为第4代。

1.4 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、肠道菌增菌液体培养基（EE）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基。氯化钠、聚山梨酯80由国药集团化学试剂有限公司提供；培养基经过适用性检查，符合标准要求。

2 方法与结果

2.1 供试液制备

2.1.1 平皿倾注法 取1.2项下供试品10 g，加入TSB至100 ml，混匀，制成1∶10的供试液。取1∶10的供试液适量，加入TSB依法制成1∶50、1∶100的不同稀释浓度供试液[8]。

2.1.2 中和法 取1.2项下供试品10 g，加入含7 g/L聚山梨酯80的TSB至100 ml，混匀，制成1∶10的供试液。取上述供试液适量，加入含7 g/L聚山梨酯80的TSB依法制成1∶50、1∶100的供试液[8]。

2.2 菌液制备

按照《中华人民共和国药典》2020版四部[9]通则1105的要求，制备成每毫升菌落数为5 000～10 000 cfu的试验菌液。

2.3 计算与结果判断

2.3.1 计算公式

2.3.2 结果判断 计数方法适用性试验中，采用平皿法时，各试验菌回收比值应在0.5～2范围内；使用中和剂时，应确认其有效性和对微生物无毒性，中和剂对照组回收比值应在0.5～2范围内；3次独立、平行试验中，若出现任一回收比值小于0.5，应采用适宜方法重新进行方法适用性试验。控制菌检查适用性试验阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌落生长[9]。

2.4 需氧菌总数预试验（选取敏感菌株）、霉菌和酵母菌总数

2.4.1 平皿倾注法 试验组1：取2.1.1项下1∶10供试液9.9 ml置入无菌试管，加入2.2项下枯草芽孢杆菌悬液0.1 ml，使每毫升供试液中含菌量不大于100 cfu，混匀，取上述溶液1 ml注入平皿，平行制备2个平皿。同法制备1∶50、1∶100的试验组，作为需氧菌总数敏感菌株预试验用。

试验组2：取2.1.1项下1∶10供试液9.9 ml置入无菌试管，分别加入2.2项下白色念珠菌和黑曲霉菌悬液各0.1 ml，其他操作同试验组1，作为霉菌和酵母菌总数计数试验用。

供试品对照组：取2.1.1项下供试液9.9 ml置入无菌试管，以稀释液代替试验菌液，其他操作同试验组1。

菌液对照组：取稀释液9.9 ml置入无菌试管，分别加入2.2项下枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液各0.1 ml，其他操作同试验组1，作为上述3种菌株的回收试验用。

上述各组平皿，按照《中华人民共和国药典》2020年版四部[9]要求，注入15～20 ml温度不超过45 ℃相对应的SDA或TSA，测定各平皿菌落数，计算3次独立试验的平均回收比值。见表1。

由表1数据可知，在需氧菌总数计数中以枯草芽孢杆菌作为敏感菌株，采用平皿倾注法（1∶100）时，回收比值仍小于0.5，表明参松养心胶囊对枯草芽孢杆菌有很强的抑制作用；采用平皿倾注法（1∶10）时，霉菌和酵母菌总数计数的试验菌回收比值均在0.5～2范围内，表明该方法有效。

表1 需氧菌总数预试验、霉菌和酵母菌总数回收比值（平皿倾注法）

2.4.2 需氧菌总数计数预试验（中和法） 分别取2.1.2项下1∶10、1∶50、1∶100供试液9.9 ml，稀释剂用含7 g/L聚山梨酯80的TSB代替TSB，加入2.2项下枯草芽孢杆菌悬液，其他操作同2.4.1步骤，制备试验组、供试品组和菌液对照组。

中和剂对照组：取含7 g/L聚山梨酯80的TSB 9.9 ml置入无菌试管，加入2.2项下枯草芽孢杆菌悬液，其他操作同2.4.1步骤，进行中和剂的菌种回收试验。

以上各组平皿，按照《中华人民共和国药典》2020年版四部[9]要求注入15～20 ml温度不超过45 ℃ TSA培养基，测定各平皿菌落数，计算3次独立试验的平均回收比值，结果供试液（1∶10、1∶50）加入中和剂时，枯草芽孢杆菌回收比值仍小于0.5，供试液（1∶100）加入中和剂时，回收比值在0.5～2范围内。

2.4.3 需氧菌总数计数正式试验 取2.1.2项下1∶100供试液9.9 ml 5份，分别加入2.2项下金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌液各0.1 ml，其他操作同2.4.2项下预试验操作制备各组平皿。按照《中华人民共和国药典》2020年版四部[9]要求注入15～20 ml温度不超过45 ℃的TSA培养基，测定各平皿菌落数，计算3次独立试验的平均回收比值。

2.4.4 试验结果 中和剂对照组菌种回收比值均在0.5～2范围内，表明含7 g/L聚山梨酯80的TSB对试验菌株无抑菌性且无损伤[10]。参松养心胶囊采用1∶100稀释中和法进行需氧菌总数计数方法适用性试验时，试验菌种的回收比值均在0.5～2范围内，表明方法可行。见表2。

表2 需氧菌总数计数适用性试验回收比值（1∶100中和法）

2.5 控制菌检查方法适用性试验

2.5.1 大肠埃希菌 阳性对照组：取2.1.1项下1∶10供试液10 ml和不大于100 cfu的大肠埃希菌悬液，接种至100 ml TSB中，混匀，33 ℃培养 24 h。供试品组：取1∶10供试液10 ml，不加菌液，其他同阳性对照组。

2.5.2 耐胆盐革兰阴性菌 预培养：取2.1.1项下1∶10供试液，在23 ℃预培养2 h，备用。阳性对照组：分别取相当于0.1 g、0.01 g和0.001 g的预培养物各2份，1份加入铜绿假单胞杆菌悬液（不大于100 cfu），1份加入大肠埃希菌悬液（不大于100 cfu），接种至10 ml EE中，33 ℃培养48 h。供试品组：取预培养物1 ml，不加菌悬液，其他同阳性对照组。

2.5.3 沙门菌 阳性对照组：取2.1.1项下供试品10 g和不大于100 cfu的乙型副伤寒沙门菌悬液，接种至100 ml TSB中，混匀，33 ℃培养24 h。供试品组：取供试品10 g，不加菌悬液，其他同阳性对照组。

以上各组取稀释剂代替供试液，其他同供试品组操作，分别制备阴性对照组。上述各组控制菌的培养物，按照《中华人民共和国药典》2020年版四部[9]规定进一步选择和分离培养，如果阳性对照组无菌落生长，表明参松养心胶囊对该菌有抑制作用，则采用增加培养基的方法，重复上述试验。

2.5.4 试验结果 按照常规培养基体积检查时，阴性对照组均无菌落生长，大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌均检出试验菌，沙门菌阳性对照组未检出试验菌。表明该样品对沙门菌有抑菌活性，将稀释液增加至200 ml时，阳性对照组菌落生长良好。见表3。

表3 控制菌方法适用性试验结果

3 讨论

药品微生物限度检查是保证用药的有效性、保障药品安全性的重要措施[11]。进行微生物限度检查时，首先采用平皿倾注法低稀释倍数进行方法学初筛，对有抑菌活性的样品，采用适宜的方法去除其抑菌活性并进行方法适用性试验才能确保检验结果的科学性和准确性[12]。

在开展方法试用性工作中以及查阅文献[6,13-15]发现，样品对某种试验菌有抑菌活性的较多，对5种试验菌株均有抑菌活性的较为罕见，而且对需氧菌总数计数试验菌株表现出抑菌活性的居多。因此本研究进行试验设计时，经过综合分析，选定枯草芽孢杆菌作为敏感菌株进行需氧菌总数方法适用性预试验，减少了试验菌液使用量和检验时的工作量，降低了试验过程中引入微生物污染的风险，提高了工作效率，可为其他实验室提供借鉴。

方法适用性试验的本质是建立对样品影响更小、操作效率更高的方法[16]。2.4项下预试验的结果表明参松养心胶囊对敏感菌株枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用，采用平皿倾注法（1∶100）时3批样品对枯草芽孢杆菌的回收比值均小于0.5，不宜继续采用增加稀释浓度的方法。在去除样品抑菌活性时，薄膜过滤法较为常用，但本品供试液含不溶性颗粒较多，难以过滤，很难通过薄膜过滤法消除抑菌成分[6]。同时薄膜过滤法操作较为繁琐，容易染菌[5]，适宜的中和剂能较好地去除样品抑菌活性，且操作简便，工作效率高。聚山梨酯80是一种非离子表面活性剂，可增加药品溶解度[17-20]，对微生物有一定保护作用[21]，因此本研究使用聚山梨酯80作为中和剂。

通过试验，建立了参松养心胶囊的微生物限度检查方法：需氧菌总数计数采用1∶100稀释中和法；霉菌和酵母菌总数计数采用平皿倾注法（1∶10）；大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌检查采用常规培养基体积，沙门菌采用培养基稀释法。该方法操作简便，能真实地反映样品实际污染微生物情况，可为药品生产企业和检验机构提供参考。