肝细胞癌组织SUMO 化修饰成员表达变化及其临床意义

刘晓智，张春艳，张立东，郑洁，刘敏，姜忠敏

天津市第五中心医院病理科，天津 300450

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤。由于HCC 起病隐匿，早期症状不典型，并且缺乏有效的早期诊断生物标志物，大多数患者就诊时已属中晚期，治疗效果有限，预后较差［1］。小类泛素化修饰因子（SUMO）是真核细胞中高度保守的翻译后修饰蛋白。在人体内SUMO 家族共有四个成员。SUMO1、SUMO2、SUMO3在所有组织中广泛表达，由于SUMO2、SUMO3 具有高度同源性，通常合写为SUMO2/3，而SUMO4 仅在特定组织中表达。SUMO家族的主要功能是对底物蛋白进行SUMO 化修饰［2］。SUMO 化修饰是人体内一种重要的蛋白质翻译后修饰类型，对转录调节、DNA 损伤修复、维持基因组完整性等具有至关重要的作用。SUMO 化修饰过程是抗原刺激下SUMO 家族在SUMO 化关键酶［SAE1、SAE2、UBC9、RanBp2 及PIAS 家 族（如PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4）］作用下引起的一系列酶促级联反应，然后与底物蛋白共价结合，从而发挥相应的生物学功能［3］。SUMO 化修饰是一个可逆的动态过程，其功能发挥后可在去SUMO 化酶（SENP家 族，如SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7）作用下使SUMO 家族与底物分离。近年研究报道，在SUMO 化修饰过程中，SUMO 家族或某些关键酶异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关［4］。本研究探讨了HCC 组织SUMO 化修饰成员表达变化及其与患者临床病理特征的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2005年1月—2019年12月在天津市第五中心医院实施手术并经术后病理检查确诊的HCC 病例癌组织石蜡标本以及购买的人HCC组织芯片标本共100 例份，癌旁大致正常肝组织石蜡标本60 例份。100 例HCC 患者中，男78 例、女22例，年龄37～71 岁、中位年龄48.5 岁；肿瘤直径：≤3.5 cm 56 例，＞3.5 cm 44 例；组织学分级：1 级15例，2 级60 例，3 级25 例；Edmondson 分级［1］：Ⅰ、Ⅱ级45 例，Ⅲ、Ⅳ级55 例。本研究经天津市第五中心医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 SUMO 化修饰成员表达检测 采用免疫组化Envision 二步法。取所有石蜡标本或组织芯片标本，5 μm厚连续切片。切片经60 ℃烘箱烤片1 h，常规脱蜡至水，微波炉加热抗原修复，3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。正常山羊血清封闭后，分别加入SUMO 家族蛋白（SUMO1、SUMO2/3）、SUMO 化关键酶（SAE1、SAE2、UBC9、RanBp2）、PIAS 家族（PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4）、SENP 家族（SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7）一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入生物精标记的二抗，37 ℃孵育30 min。DAB 显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，自来水反蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。以已知的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

采用双盲法由两位病理科医师独立阅片，意见不一致时协商解决。SUMO 家族蛋白、SUMO 化关键酶、PIAS 家族、SENP 家族阳性染色定位于细胞质或细胞核，呈棕黄色颗粒状。随机选取10 个不重叠的高倍镜视野（10×40），评估染色强度，计数每高倍镜视野下阳性细胞数和总细胞数，计算阳性细胞比例。染色强度评分：不着色为0 分，黄色为1分，棕黄色为2 分，黄褐色为3 分。阳性细胞比例评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞比例≤25%为1 分，阳性细胞比例＞25%～50%为2 分，阳性细胞比例＞50%为3 分。以阳性细胞比例评分和染色强度评分综合评定阳性表达，二者评分之和≥2 分为阳性表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5 统计软件。计数资料以例（%）表示，结果比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织与癌旁正常肝组织SUMO 化修饰各成员阳性表达比较 见表1。

表1 HCC组织与正常肝组织SUMO化修饰各成员阳性表达比较［例（%）］

2.2 HCC 组织SUMO 家族蛋白表达与患者临床病理特征的关系 见表2。

表2 HCC组织SUMO家族蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系

2.3 HCC 组织SUMO 化关键酶阳性表达与患者临床病理特征的关系 见表3。

表3 HCC组织SUMO化关键酶阳性表达与患者临床病理特征的关系

3.4 HCC组织PIAS家族成员阳性表达与患者临床病理特征的关系 见表4。

表4 HCC组织PIAS家族成员阳性表达与患者临床病理特征的关系

2.5 HCC 组织SENP 家族成员阳性表达与患者临床病理特征的关系 见表5。

表5 HCC组织SENP家族成员阳性表达与患者临床病理特征的关系

3 讨论

SUMO 是20 世纪90 年代在真核细胞中发现的一种高度保守的翻译后修饰蛋白。人类SUMO 家族共有四个成员，即SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4，主要功能是对底物蛋白进行SUMO 化修饰［2］。SUMO 化修饰过程与泛素化过程类似，通过与底物蛋白的赖氨酸残基共价结合，促发一系列酶促级联反应［5］。SUMO 家族被E1 激活酶活化后，被转移至E2 结合酶的半胱氨酸残基上，从而直接识别底物蛋白，并最终通过异肽键将SUMO 偶联到底物蛋白的赖氨酸残基上［6］。E3 连接酶可以增强E2 结合酶转至SUMO 到底物蛋白的效率和特异性。SUMO 化修饰是一个可逆的动态过程，SUMO 在去SUMO 化酶作用下从底物蛋白上被剪切下来，重新进入新的SUMO 化修饰循环［7］。蛋白质SUMO 化修饰可参与维持基因组稳定、调节蛋白核浆移位、调控蛋白间相互作用及转录因子活性等生物学功能，进而调控多种疾病的发生、发展［8］。SUMO化修饰过程主要包括2 个关键蛋白（SUMO1、SUMO2/3）和14 个关键酶（SAE1、SAE2、UBC9、RanBp2、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7），该过程中某些蛋白或关键酶表达异常，可使SUMO 化修饰循环的稳态被破坏，从而有助于肿瘤的发生。迄今为止，在多种恶性肿瘤中发现了大量异常表达的SUMO 化修饰成员。如SUMO2/3 过表达可导致细胞无限增殖，促进了急性白血病发生［9］。在乳腺癌组织中SENP7、SENP1、UBC9 表达异常，它们通过不同的SUMO 化修饰位点及SUMO化修饰途径调控乳腺癌的发生、发展［10］。AKIL 等［11］研究表明，SUMO1 在肝癌细胞中表达上调，并且其表达上调与肝癌的多药耐药密切相关。另有研究报道，SUMO1 能够促进肝癌细胞的侵袭和迁移，从而促进肝癌进展［12］。但目前SUMO 化修饰在HCC 中的研究仅限于个别成员，缺少对SUMO 化修饰成员的系统研究。

本研究结果发现，HCC组织SUMO1阳性表达率明显高于癌旁正常肝组织，而HCC 组SENP1、SENP2、SENP3、PIAS2、PIAS4、SAE2 阳性表达均低于癌旁正常肝组织，与ZUBIETE-FRANCO 等［12］研究结果相似，提示这些SUMO 蛋白和关键酶可能在肝细胞癌变过程中具有重要作用。本研究结果还发现，除Edmondson 分级Ⅲ、Ⅳ级者SUMO1、UBC9、SENP6和SENP7阳性表达率均高于Edmondson 分级Ⅰ、Ⅱ级者外，SUMO 化修饰各成员与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分级、Edmondson 分级均无明显相关性，提示SUMO 化修饰成员SUMO1、SENP6、SENP7、UBC9可能在HCC演进过程中扮演重要角色。

综上所述，HCC 组织SUMO 化修饰成员SUMO1表达上调，SENP1、SENP2、SENP3、PIAS2、PIAS4、SAE2表达下调，其表达变化可能在肝细胞癌变过程中具有重要作用；SUMO化修饰成员SUMO1、SENP6、SENP7、UBC9阳性表达与Edmondson分级有关，其表达变化可能在HCC演进过程中扮演重要角色。