胃癌组织中RAC1的表达变化与临床病理特征及预后的关系

李影，黄幼生，解娜，2，翁阳

1 海南医学院第一附属医院病理科，海口 570102；2 海南医学院口腔组织病理学教研室

胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，患者生存期、预后与胃癌高侵袭、转移、复发相关［1］。尽管胃癌多模式治疗（全身化疗、放疗、手术、免疫治疗等）取得很大进步，但晚期胃癌5 年生存率仍不到20%，这可能与肿瘤细胞的高度异质性有关［2-3］。因此，探索新的与胃癌发生、发展相关的生物学标记物，为胃癌个体化治疗提供新的靶点具有重要意义。Ras 相关的C3 肉毒素底物1（RAC1）是Rho-GTPase 家族中最重要的成员之一［4］，在细胞骨架重塑、运动和周期转运中发挥关键作用［5］。RAC1 主要存在2 种形式，活性RAC1（RAC1-GTP）和非活性RAC1（RAC1-GDP）［6-8］。大部分RAC1-GTP 是不活跃的，当RAC1 被激活时，参与肌动蛋白应力纤维和黏附斑块的形成，促进细胞骨架重组，调节片状伪足和丝状伪足延伸，影响细胞的结构和极化，促进细胞运动和迁移，抑制细胞凋亡［9］。研究发现，RAC1 过度激活与乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌等进展、转移、治疗抗性和总体预后差有关，有望成为肿瘤靶向治疗的候选靶点［10］。然而在胃癌组织中，RAC1-GTP 与患者临床病理特征及预后的关系尚不清晰。我们基于癌症基因组图谱（TCGA）数据分析RAC1 mRNA 的表达与胃癌临床病理特征及预后的关系，并收集胃癌患者临床资料，进一步验证生物信息学分析结果。

1 资料与方法

1.1 临床资料 从TCGA 数据库（https：//www.cancer. gov）下载RNA 表达谱和胃癌患者的临床数据，共收集445 份胃癌样本，删除信息不匹配或数据不完整的样本，最终纳入胃癌样本386份，其中配对样本27 份。收集2020 年1 月—2021 年10 月海南医学院第一附属医院临床病理科存档的62 份胃癌及其配对正常胃黏膜石蜡标本。从上海芯超生物科技有限公司购买有完整随访信息的组织芯片1张，其阵列编号为HStm-Ade180Sur-06，芯片批号XT14-008，芯片共有样本90 例，包括癌及癌旁正常胃黏膜组织。患者术前均未接受放疗或化疗，病理分期参照第8 版美国癌症联合委员会（AJCC）发布的胃癌分期标准。所有标本的获取经过海南医学院第一附属医院伦理委员会审核通过，并获得患者或其家属知情同意。

1.2 组织芯片构建 取62 份胃癌及其配对正常胃黏膜石蜡标本，切片，HE染色，显微镜下标记具有代表性的正常组织及非坏死区域肿瘤组织，用内径

1.5 mm 的中空管芯，从标记好的供体蜡块中获取目标组织芯柱，并用直径1.3 mm 的实性管芯插入中空管芯，顶出组织芯柱，填充到受体蜡块模孔中。热蜡封边，60 ℃恒温烤箱烤1 h，室温放置30 min，再放入4 ℃冰箱冷冻后脱模。粗修后以3~5 μm 厚度切片，置于组织防脱片上。以胃肠道间质瘤为起始标记点。

1.3 胃癌及其正常胃黏膜组织芯片中RAC1 mRNA表达检测 采用RNAscope法。用RNAscope2.5 HD试剂盒对甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本进行RAC1 mRNA 原位杂交检测。操作步骤参照说明书，组织切片用二甲苯、100%乙醇脱蜡，双氧水孵育10 min，RNAscope 靶标修复试剂孵育15 min，RNAscope 蛋白酶Plus 孵育30 min。然后将载玻片与RAC1 mRNA 探针在HybEZ 杂交炉（美国ACD 公司）中40 ℃孵育2 h，杂交洗涤后，使用HD2.5 检测试剂盒（美国ACD 公司）对载玻片进行信号放大，并使用Fast-RED 溶液A 和B（1∶60）混合物检测杂交信号。用50%苏木精Ⅰ进行复染，随后将载玻片在60 ℃干燥烘箱中干燥15 min 后封片。人类管家基因PPIB 为阳性对照，DapB 为阴性对照。标准显微镜（20~40 倍）下检查RNAscope 结果。参照RNAscope®2.5HD 可见光红色试剂盒用户手册半定量评分指南，将每个细胞的信号点数量估计值作为判断标准，每10 个细胞的染色点少于1 个信号点为0 分，1~3 个信号点/细胞为1 分，4~10 个信号点/细胞（非常少的细胞簇状点）为2 分，＞10 个信号点/细胞（具有簇状信号点的阳性细胞少于10%）为3分，＞10 个信号点/细胞（具有簇状信号点的阳性细胞少于10%）为4 分［11］。评分＜2 分为低表达，评分≥2 分为高表达。

1.4 胃癌及其正常胃黏膜组织中RAC1-GTP 蛋白表达检测 采用免疫组化法。石蜡芯片经切片、烤片、二甲苯脱蜡、水化、阻断过氧化物酶后，Tris-EDTA 修复液热修复法修复12 min、冷却7 min。RAC1-GTP 一抗（1∶200，武汉纽斯特生物技术有限公司）37 ℃孵育1 h。PBS 清洗5 min×3 次，二抗（福州迈新生物技术开发有限公司）37 ℃孵育20 min。PBS 清洗5 min×3 次，DAB 显色（福州迈新生物技术开发有限公司）至阳性对照明显的棕黄色，洗涤后苏木精衬染1 min。结果判定标准：阳性细胞染色定位在细胞膜和（或）细胞质，呈淡黄色、棕褐色颗粒。根据阳性细胞数百分比及阳性细胞染色强度进行评分，阳性细胞数百分比＜5%为0 分、5%~25%为1 分、＞25%~50%为2 分、＞50%为3 分；无着色（0 分）、淡黄色为1 分、棕黄色为2分、黄褐色为3 分。两项评分相乘结果＜3 为低表达，≥3 为高表达［12］。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布计量资料用-x±s表示，比较采用独立样本t检验；计数资料用率或例表示，比较采用χ2检验；单变量生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法；用Cox 比例风险模型分析胃癌患者预后的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA 数据库中RAC1 mRNA 表达变化及其与患者临床病理特征的关系 TCGA 数据库中胃癌组织中RAC1 mRNA 相对表达量（155.1 ± 43.6）高于癌旁正常胃黏膜组织（116.0 ± 30.1），差异有统计学意义（P＜0.05）。RAC1 mRNA 表达变化与胃癌发病部位、浸润深度有关（P均＜0.05），见表1。以RAC1 mRNA 表达的均值为界，分为高表达、低表达。RAC1 mRNA 高表达与低表达胃癌患者中位生存期分别为396、500 d，比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 TCGA数据库中RAC1 mRNA表达与胃癌患者临床病理特征的关系（例）

2.2 胃癌组织中RAC1 mRNA 表达变化及其与患者临床病理特征关系的临床验证 胃癌组织中RAC1 mRNA 高表达率为80.6%（50/62）、低表达率为19.3%（12/62）；癌旁正常胃黏膜组织中RAC1 mRNA低表达率为90.3%（56/62）、高表达率为11.5%（6/62）。二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。RAC1 mRNA的表达变化与胃癌患者性别、年龄及肿瘤发生部位、最大径、分化程度、浸润深度、病理分期、脉管侵犯、淋巴结转移均无关（P均＞0.05）。见表2。

2.3 胃癌组织中RAC1-GTP蛋白表达变化及其与患者临床病理特征的关系 胃癌组织中RAC1-GTP 蛋白在胞质内点状或弥漫表达，低表达率为22.3%（34/152）、高表达率为77.6%（118/152）；癌旁正常胃黏膜组织中RAC1-GTP 蛋白不表达或胞质内点状表达，低表达率为84.8%（129/152）、高表达率为15.1%（23/152）。二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。RAC1-GTP蛋白表达变化与胃癌浸润深度、病理分期、脉管侵犯、淋巴结转移有关（P均＜0.05）。见表2。

表2 RAC1 mRNA及RAC1-GTP蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系（例）

2.4 RAC1-GTP蛋白表达与胃癌患者预后的关系 有完整随访资料的胃癌组织芯片90 份，采用电话随访的方式，随访时间为1~83 个月。RAC1-GTP 蛋白低表达、高表达患者的中位生存期分别为80、20个月，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 RAC1-GTP 对胃癌患者预后的影响 单因素Cox 回归分析显示，90 例胃癌患者预后与肿瘤分化程度、浸润深度、病理分期、脉管侵犯、淋巴结转移及RAC1-GTP 蛋白表达有关（P均＜0.05）。多因素Cox回归分析显示，肿瘤病理分期高、RAC1-GTP 蛋白高表达是胃癌预后的独立风险因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 影响胃癌患者预后的单因素、多因素分析

3 讨论

RAC1 被认为是一种促进人类癌症恶性转化和进展的癌基因［13］。RAC1 在多种恶性肿瘤（肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、肝细胞癌等）中高表达及活性增强［14］。RAC1 的活化与肿瘤进展、转移、治疗抗性以及各种实体肿瘤患者的总体预后较差有关［10］。我们前期研究显示，RAC1 在胃癌组织中高表达，与淋巴结转移、浸润深度、TNM 分期相关［15］；在结直肠癌中miR-142-3p 模拟物转染结肠癌细胞可抑制RAC1 的表达，降低癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力［16］。以上研究证实RAC1 在人类癌症中起关键作用。

随着基因组科学和下一代测序技术的发展，在大量生物体中发现了丰富的基因组信息，新的蛋白质生物信息学数据库也正在被引入。已经开发的许多公开可用的数据存储库和资源可帮助我们快速找到合适的蛋白质相关信息学资源［17］。本研究首先通过TCGA 数据库分析RAC1 mRNA 的表达及其与临床病理特征的关系，结果显示RAC1 mRNA 在胃癌中高表达，且RAC1 mRNA 表达与肿瘤部位、浸润深度有关，与患者的性别、年龄、病理分期、淋巴结是否转移、生存期无关。此结果与后续RNAscope®原位杂交结果不完全一致，可能与其数据库中的数据来源不同有关。

为验证以上结论，本研究选用来自海南医学院第一附属医院病理科的胃癌组织标本，制作胃癌组织芯片。相比传统的全组织切片，组织芯片有以下几点优势：实验条件一致，减少样本间实验偏差；降低免疫组化的试剂成本和不同组织间的染色差异，减少实验错误；经济优势，节省了消耗品和劳动力；操作程序更快速，可以节省大量时间；最低最大限度地减少组织的使用［18-20］；在组织芯片中进行免疫组化及原位杂交检测，操作更为便捷，结果更为可靠。由于临床胃癌组织新鲜标本难以取得，且mRNA 容易降解，不易在石蜡组织切片中检测到。近年来，RNAscope®在肿瘤（包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胃腺癌、食管癌、淋巴瘤、尿路上皮癌等）的研究中都有应用，非常有效且特异地检测到mRAN 的表达。据此我们选用RNAscope®检测RAC1 mRNA 在胃癌组织中的表达。RNAscope®是一种新的现代原位杂交技术，具有高度敏感性和特异性，具有独特的探针设计策略（双Z 设计），可以同时进行信号放大和背景噪声抑制［21］，实现单分子的可视化，同时在甲醛固定、石蜡包埋组织切片中保留组织形态［22］。与聚合酶链反应分析相比，它更稳定方便，还可在光学显微镜下在甲醛固定和石蜡包埋切片中观察单细胞水平的mRNA［23］。与其他方法相比，它采用的探针池允许检测片段化RNA，解决了在常规甲醛固定石蜡包埋标本中检测部分降解的RNA 这一难题［21］。我们利用RNAscope®也同样在胃癌及其配对组织中观察到RAC1 mRNA 明显的表达信号。在普通光学显微镜下可以直观地观察到每个细胞内出现的RAC1 mRNA 红色信号点。结果显示，胃癌组织RAC1 mRNA 高表达率高于癌旁正常胃黏膜组织；但与胃癌临床病理特征无明显相关性。说明RAC1 mRNA 表达的增高可能是胃癌发生的一个早期分子事件。

研究结果显示，总RAC1 的免疫反应性不能作为乳腺癌患者的预后因素，是由于RAC1 mRNA 或RAC1 蛋白的数量并不总是反映RAC1 的活性；且RAC1-GTP 表达与乳腺癌患者的细胞增殖和不良预后密切相关［24］。也有研究表明，RAC1-GTP 参与结直肠癌干细胞的调节，RAC1-GTP 在结直肠癌组织中的表达水平与TNM 分期、淋巴结转移、远处转移以及患者的生存显著相关［10，25］。本研究结果同样显示，RAC1-GTP 蛋白在胃癌组织中高表达，与肿瘤的浸润深度、病理分期、脉管侵犯、淋巴结转移有关，且RAC1-GTP 高表达是胃癌患者预后不良的独立风险因素。

总之，本研究证明RAC1 mRNA 及RAC1-GTP在胃癌组织中高表达，并且RAC1-GTP 高表达与肿瘤的浸润深度、病理分期、脉管侵犯、淋巴结转移有关，说明RAC1 的活性状态的高低与胃癌的进展有关；并且RAC1-GTP 的高表达与胃癌患者的不良预后密切相关，或能成为胃癌新的预后指标及潜在的治疗靶标。本研究仅从组织学水平证明RAC1 与胃癌进展存在密切关系，从细胞水平及活体内进一步深入研究将有助于阐明RAC1 促胃癌发展的作用机制。